原生质体和单孢杂交技术在茯苓育种中的应用

摘要

茯苓Wolfiporia cocos是我国重要的药用真菌，其地下形成的菌核是我国传统中药，具有很高的药用、食用和保健价值。茯苓的研究基础薄弱，茯苓育种至今仍停留于从野生或驯化菌株中进行选择的水平，同质化和退化现象严重，在生产上常造成很大经济损失。本研究基于前期茯苓性模式研究的基础上，利用原生质体技术和单孢杂交技术，进行了茯苓优良菌株选育工作，具体试验设计及结果如下：
　　（1）以茯苓菌株T1、P0和5.78为材料，利用原生质体再生进行复壮，分离得到若干分离株，经过CYM培养基、松木屑培养基上生长速度测定进行初筛，共获得25个T1原生质体再生菌株，13个P0原生质体再生菌株，17个5.78原生质体再生菌株，将这些初筛菌株进行田间栽培试验，以平均每窖菌核产量为重要考核指标，筛选到18个T1原生质体再生菌株，2个P0原生质体再生菌株，9个菌株5.78原生质体再生菌株的产量高于亲本菌株的复壮菌株。
　　（2）以茯苓菌株T1和P0为材料，利用原生质体融合技术，分离得到103个再生菌株，对这些再生菌株采用拮抗试验和SRAP技术进行了原生质体融合子鉴定试验，共获得76原生质体融合子。对这些原生质体融合菌株进行了CYM培养基、松木屑培养基上生长速度测定。将这些初筛菌株进行田间栽培试验，结果表明融合子R51，R74，R95，R73的平均每窖产量与亲本菌株T1的产量差异达到了极显著水平，融合子R50，R52的平均每窖产量与亲本菌株T1的产量差异达到了显著水平。原生质体融合子菌株R51，R74，R95，R73，R50，R52在菌核产量上比T1分别提高了129％，127%，91%，82%，67%，64%。同时综合SRAP扩增结果，发现这6个菌株中，R73的条带与亲本T1一样，R74，R52出现了两亲本都没有的新条带，R51，R95，R50中出现两亲本特异性条带，证实R51，R74，R95， R50，R52这5个融合子菌株综合了两亲本菌株的遗传物质，是真正的融合子。因此，原生质体电融合育种手段对于提高茯苓菌株菌核产量是有效的。
　　（3）以茯苓菌株W、L和DB的若干个单孢菌株为材料，采用单孢杂交技术进行了茯苓单孢杂交育种初探。研究结果表明，无论是菌株内单孢杂交，还是菌株间单孢杂交，其交配反应类型分为3种，分别为融洽生长型、隆起型和沟状型。进一步对不同交配型反应类型交接处菌丝体与两亲本单孢菌株及亲本单孢菌株的出发菌株进行了拮抗试验，研究结果表明，分别有15个 W和 L的单孢杂交菌株、44个 W和 DB的单孢杂交菌株为杂交成功菌株。此外，研究还发现，这些杂交成功菌株的两亲本单孢菌株配对反应均为融洽生长型。本研究进一步采用信息分析学技术，开发了1对用于茯苓杂交子鉴定的 SNP分子标记，并成功诱导出杂交子子实体。以传统的“段木覆土栽培”对杂交子和亲本单孢进行了田间栽培，结果表明，栽培的杂交菌株中，有1个W和L的单孢杂交子菌株结苓，有22个W和DB的单孢杂交子菌株结苓，产量介于0.05-0.87 kg之间；栽培的62个亲本单孢菌株中，有6个单孢可以结苓，其余亲本单孢菌株不能结苓。此外，3种类型亲本单孢的出发菌株的产量分别为W菌株0.45 kg，L菌株0.58 kg，DB菌株0.44 kg。

目录

声明

1 前言

1.1茯苓概述

1.1.1茯苓的分类地位及形态特征

1.1.2茯苓的生态习性与资源分布

1.1.3 茯苓栽培现状

1.2 食药用菌育种技术

1.2.1 选择育种

1.2.2 杂交育种

1.2.3 诱变育种

1.2.4 原生质体融合育种

1.3杂交后代筛选方法

1.3.1 生物学鉴定

1.3.2 生理生化鉴定

1.3.3分子生物学鉴定

1.4 研究目的与意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 供试菌株

2.1.2 供试培养基

2.1.3 供试试剂

2.2 试验方法

2.2.1原生质体的制备

2.2.2原生质体制备最优条件正交试验设计方案

2.2.3原生质体电融合

2.2.4单孢杂交配对

2.2.5 杂交子鉴定

2.2.6茯苓菌株生长速度的测定

2.2.7栽培试验

2.2.8 单孢菌株和杂交子菌株的羧甲基纤维素酶酶活测定（DNS法）

2.2.9 原生质体融合子和单孢杂交子的分子鉴定

3 结果与分析

3.1.1茯苓原生质体的观察

3.1.2茯苓原生质体制备的影响因素及最佳条件

3.2原生质体技术提纯复壮

3.2.1原生质体再生菌株制备

3.2.2原生质体再生菌株生长速度测定结果

3.2.3原生质体再生菌株田间栽培结果

3.2.4原生质体再生复壮小结

3.3原生质体电融合育种结果

3.3.1 原生质体电融合

3.3.2融合子鉴定

3.3.3 原生质体融合子生长速度测定结果

3.3.4 原生质体融合子田间栽培结果

3.4茯苓单孢配对反应类型

3.4.1 菌株内单孢配对反应类型

3.4.2 菌株间单孢配对反应类型

3.5 拮抗技术对茯苓单孢杂交子的鉴定结果

3.5.1 菌株内单孢杂交子的鉴定结果

3.5.2 菌株间单孢杂交子的鉴定结果

3.6 SNP分子标记开发及用于茯苓单孢杂交子的鉴定结果

3.6.1 SNP分子标记开发

3.6.1单孢杂交子的鉴定结果

3.6.2单孢配对杂交子子实体诱导结果

3.7 杂交子的生长速度测定结果

3.8 单孢杂交子的田间栽培结果

3.9 部分单孢菌株及单孢杂交子的羧甲基纤维素酶酶活测定结果

4 讨论

参考文献

致谢