小麦韧皮部筛分子程序性细胞半死亡中的BEN1-LIKE蛋白和Zn2+的定位与功能初探

摘要

小麦（TriticumaestivumL.）颖果韧皮部筛分子(Sieve elements，SEs)的主要功能是运输营养物质。已有研究证明，小麦颖果韧皮部筛分子发育时间在0～7DAF，期间经历了一个独特的细胞程序性死亡过程——细胞程序性半死亡，即该程序性死亡由于多种原因中途停滞，并没有进行到底。其发育过程中细胞器和细胞质发生有序降解，但成熟筛分子仍保留少量细胞质和完整细胞质膜，仍有活性和执行养分运输功能。目前，关于筛分子细胞程序性半死亡的研究报道较少，其发育机理还有许多未知的方面。例如，筛分子发育时细胞核会发生降解，但细胞核降解过程是如何调控的？是否有某些蛋白酶参与了核降解的调控过程？这些蛋白酶的活性和相关基因的表达是否与细胞程序性死亡中止有关？为了解决上述问题，本次实验研究采用显微和超微免疫组织化学定位法、原位杂交定位法和多种分子生物学技术，研究了小麦颖果韧皮部筛分子发育过程中BEN1-LIKE（大麦核酸内切酶）蛋白和Zn2+的定位，并对Ⅱ型Metacaspase（半胱氨酸蛋白酶）基因和caspase-3-like（半胱天冬酶-3）蛋白进行了初步检测，得到了如下主要结论:
　　1、在筛分子发育过程中，细胞核降解主要发生在2～5DAF。3DAF，细胞核开始发生明显变形内陷。4DAF，细胞核裂解的残留物质被液泡吞噬降解。在5DAF，细胞核基本被完全降解;液泡膜局部与细胞质膜发生膜融合，融合区间包含了部分细胞内含物。
　　2、小麦颖果腹部维管束组织DNA凝胶电泳结果显示出DNAladder现象，为PCD的典型特征。荧光定量PCR显示，小麦颖果腹部维管束组织中两个Ⅱ型Metacaspase基因（TeaMCAⅡ和TaMCA4）有超表达，且有相似的表达趋势，即均在1～6DAF达到最高。Caspase-3-like蛋白的免疫组化检测结果显示，1DAF和2DAF的小麦筛分子中阳性信号较3～7DAF的明显增强。
　　3、荧光定量PCR显示，BEN1-LIKE基因也在小麦腹部组织中有超表达，且在3DAF达到最高;通过免疫组织化学法检测，发现在显微细胞水平上BEN1-LIKE蛋白主要定位在3DAF和4DAF的韧皮部筛分子中。另外，mRNA原位杂交检测发现，在3DAF和4DAF，BEN1-LIKE的mRNA转录信号最明显。免疫电镜检测进一步在超微亚细胞水平上发现BEN1-LIKE蛋白主要定位在筛分子细胞核上。
　　4、TSQ-Zn2+荧光探针检测发现，反映筛分子Zn2+浓度的蓝色荧光信号在3DAF和4DAF时比2DAF和5DAF要强，表明筛分子内源Zn2+的浓度先增加后减少，该变化趋势与BEN1-LIKE蛋白的变化有高度的的关联性。
　　综上所述，在筛分子发育过程中检测到Ⅱ型Metacaspase基因（TeaMCAⅡ和TaMCA4）的表达以及caspase-3-like蛋白的定位，推测它们可能在筛分子的分化发育初期起作用。根据BEN1-LIKE蛋白的动态变化与细胞核降解的时间推测，BEN1-LIKE蛋白可能参与了筛分子发育过程中细胞核的降解。另外，由于筛分子内源Zn2+的浓度变化与BEN1-LIKE蛋白的表达趋势相似，推测其可能影响BEN1-LIKE蛋白的活性变化，最终导致筛分子编程性死亡终止;在发育后期部分液泡膜与细胞质膜融合可能保留了融合区间的少量细胞内含物，从而有利于筛分子保持细胞活性。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 韧皮部筛分子的研究进展

1．2 细胞程序性死亡的研究进展

1．2．1 动物细胞程序性死亡

1．2．2 植物细胞程序性死亡

1．3 本研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 材料培养

2．2 方法

2．2．1 筛分子发育的显微结构观察

2．2．2 筛分子发育的超微结构观察

2．2．3 DNA ladder检测

2．2．4 Ⅱ型Metacaspase基因相对表达量检测

2．2．5 Caspase-3 like蛋白的免疫组织定位

2．2．6 BEN1-LIKE基因相对表达量检测

2．2．7 BEN1-LIKE蛋白的mRNA原位杂交

2．2．8 BEN1-LIKE蛋白的显微和超微免疫定位

2．2．9 内源Zn2+的荧光检测

2．2．10 数据分析

3 结果与分析

3．1 小麦颖果韧皮部筛分子显微结构

3．1．1 小麦颖果形态

3．1．2 筛分子显微结构

3．2 小麦颖果韧皮部筛分子发育时细胞核的超微结构变化

3．3 小麦腹部维管束组织DNA ladder现象

3．4 Ⅱ型Metacaspase在小麦腹部维管束组织的相对表达量

3．5 Caspase-3-like蛋白的免疫化学定位

3．6 BEN1-LIKE基因在小麦颖果腹部维管束组织的相对表达量

3．7 小麦颖果韧皮部筛分子发育时BEN1-LIKE的动态变化

3．7．1 BEN1-LIKE mRNA原位杂交

3．7．2 BEN1-LIKE蛋白的免疫化学定位

3．8 小麦颖果韧皮部筛分子内源Zn2+的动态变化

4 讨论

4．1 小麦韧皮部筛分子程序性半死亡过程中细胞超微结构变化

4．2 Caspase-3-like蛋白和Ⅱ型Metacaspase基因与韧皮部筛分子发育的关系

4．3 BEN1-LIKE蛋白和内源Zn2+变化与韧皮部筛分子的程序性半死亡密切相关

4．3．1 BEN1-LIKE蛋白与韧皮部筛分子程序性半死亡的关系

4．3．2 Zn2+变化与韧皮部筛分子程序性半死亡的关系

4．4 研究方法的创新性和不足

4．5 展望

参考文献

附录1 论文图版

附录2 在读期间发表和拟发表的文章

致谢