猪附红细胞体病垂直传播和断奶应激对猪附红细胞体病影响的研究

摘要

附红细胞体病(Eperythrozoonis)是由附红细胞体（Eperythrozoon，E）引起的一种人兽共患传染病，简称附红体病，以贫血、黄疸和发热为主要特征。目前本病流行相当广泛，由于附红细胞体至今不能在体外培养，缺乏有效的诊断和防控措施，且猪附红细胞体病具有隐性感染、慢性迁延、条件致病、急性发病时致死率高等特征，所以会对规模化猪场造成较大危害。
　　猪附红细胞体病传播方式尚不明确，尤其是垂直传播问题，一直没有确凿的证据证明该病存在垂直传播途径。同样，作为条件性致病疾病，国内外关于断奶应激对猪附红细胞体病的调查研究一直处于空白阶段。本研究通过特异性 PCR检测技术和MSG-ELISA诊断方法调查猪附红细胞体病垂直传播和断奶应激问题，主要做了以下四个方面的工作：
　　（1）猪附红细胞体病PCR检测方法的建立
　　根据已发表的猪附红细胞体16S rRNA基因组序列，本实验设计合成特异性引物，建立了敏感性和特异性较好的PCR方法，最佳退火温度为53℃，最佳循环次数为34次，扩增片段大小为289 bp，将目的片段连接pMD19-T载体，提取阳性质粒鉴定、测序，并与GenBank上猪附红细胞体基因组序列进行比对和同源性分析，发现目的片段与国外报道的猪附红细胞体Illinois株、KI3806株16S rRNA基因序列相似性为100.0％。特异性试验结果显示只有猪附红细胞体阳性模板可以扩增出特异性目的条带，而温氏附红细胞体、环形泰勒虫、东方巴贝斯虫、弓形虫、猪瘟病毒和蓝耳病病毒样品没有条带。敏感性试验发现最低可检测出0.007 fg质粒 DNA浓度，敏感性极高。利用建立的PCR方法对30份临床健康猪血样进行检测，4份样品检测结果为阳性，阳性率为13.3%，证明可检测隐性感染猪。该方法为猪附红细胞体病诊断、流行病学调查及致病机理的研究等奠定了基础。
　　（2）猪附红细胞体病垂直传播调查
　　利用建立的特异性PCR方法对规模化猪场进行猪附红细胞体病垂直传播调查。跟踪监测220头同批次怀孕母猪，在其分娩时采集母猪耳静脉抗凝血和仔猪脐带抗凝血，经PCR检测发现，220头分娩母猪中，有16头猪附红细胞体PCR检测阳性，阳性率为7.3%（16/220）。16头阳性母猪所产的58头仔猪脐带抗凝血经PCR检测，有3份阳性，垂直传播率为18.8%（3/16），3对阳性母、仔猪附红细胞体病原序列相似性为100%。另外，随机抽取20份阴性母猪所产仔猪脐带血，经PCR诊断，全部为阴性。试验结果表明，猪附红细胞体病存在垂直传播情况，但是垂直传播率较低，这可能与仔猪个体差异有关。本实验的调查结果为猪附红细胞体病垂直传播方式的确认提供一个数据的支持，对该病的流行病学和防控具有重要意义。
　　（3）猪附红细胞体病断奶应激调查研究
　　断奶应激对仔猪生长、行为、食欲、免疫以及疾病发病率等方面会产生一系列不良影响。利用实验室建立的MSG-ELISA进行规模化猪场3周龄断奶仔猪附红细胞体病断奶应激调查研究，检测发现，3周龄仔猪（472份）抗体阳性率为15.04%，断奶后一周仔猪（484份）阳性率为22.11%，断奶后两周仔猪（487份）阳性率为18.28%。结果显示3周龄仔猪经断奶应激后一周猪附红细胞体病发病率增高，两周后仔猪发病率有所降低，但仍高于3周龄仔猪，说明断奶应激可以导致仔猪附红细胞体病发病率升高，丰富了猪附红细胞体病的流行病学资料。
　　（4）抗菌肽的原核表达
　　日粮中添加抗菌肽既可以减少断奶仔猪腹泻，增加畜禽抗病力，又可提高畜禽产品品质。本研究根据抗菌肽 Drosomycin氨基酸序列和大肠杆菌密码子偏爱性设计合成其基因序列，与pET-32a载体连接后，利用大肠杆菌原核表达系统成功获得Drosomycin融合蛋白，并通过镍柱进行纯化，但是未能通过肠激酶切割获得目的蛋白。

目录

声明

缩略语表

1文献综述

1.1猪附红细胞体病诊断方法研究进展

1.2 防治

1.3 国内外猪附红细胞体病垂直传播调查

1.4 仔猪断奶应激研究进展

2 研究目的与意义

3 材料与方法

3.1试验材料

3.2试验方法

4 结果与分析

4.1 特异性PCR方法的建立

4.2 垂直传播调查

4.3 猪附红细胞体病断奶应激调查

4.4 抗菌肽Drosomycin的原核表达及纯化

5 讨论

5.1 猪附红细胞体PCR方法评价

5.2 垂直传播调查结果分析与讨论

5.3 断奶应激调查结果分析与讨论

5.4 原核表达获得抗菌肽结果分析与讨论

6 结论

参考文献

致谢

附录