不同地理源蜂胶酚类物质分析及其对变形链球菌抑制作用研究

摘要

近年来由于蜂胶在医药学中的广泛应用而受到很高的关注，它具有抗氧化、抑菌、消炎、抗肿瘤等生物活性，而这些生物活性与其复杂的化学成分有密切关系，因此对其化学成分及生物活性的研究具有很高的科学价值。中国地域广大，跨越温带、亚热带、热带地区，各地蜂胶性状不同，而环境地理条件与蜂胶品质之间的关系近年来成为蜂胶研究的重点，因此本论文采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用法(Highperformanceliquidchromatography-ElectrosprayIonization-massspectrometry/massspectrometry,HPLC-ESI-MS/MS)分析中国蜂胶乙酸乙酯提取物(Ethylacetateextractionofpropolis，EaEP)中的酚类化合物，对蜂胶中含有的7种典型黄酮类化合物进行定量分析，并研究中国不同地理源EaEP对变形链球菌（Streptococcimutans，S.mutans）生长、产酸、粘附的影响，建立环境地理条件对蜂胶酚类化合物的影响及其与蜂胶抗龋齿活性的联系，通过扫描电镜与透射电镜对加入EaEP前后的S.mutans进行形态学观察，探索蜂胶酚类化合物对S.mutans的抑菌机理。主要研究内容和实验结果如下:
　　1.蜂胶酚类化合物的提取与HPLC分析方法的建立:通过比较蜂胶乙酸乙酯、95％乙醇、70％乙醇提取物对S.mutans在玻璃管壁的粘附抑制率，发现EaEP对S.mutans在玻璃管壁上的粘附抑制率最高，高于95％和70％乙醇提取物，也高于对照物NaF，说明EaEP的抗龋齿活性优于其他两种溶剂提取物，因此采用乙酸乙酯作为本研究蜂胶活性成分的提取溶剂。在此基础上，建立了分离EaEP中酚类化合物的反相高效液相色谱-二极管阵列(Reversedphasehighperformanceliquidchromatography-Diodearraydetector,RP-HPLC-DAD)条件:流动相A为0.3％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，检测波长为280nm，使用ThermoHypersilGOLDC18(250mm×4.6mm，5.0μm)色谱柱在柱温30℃，流速1mL/min条件下，以梯度洗脱的方式分离蜂胶酚类化合物，所分离物质基本上可以达到基线分离。方法学考察精密度、稳定性、重复性的相对标准偏差都控制在5％内，10种黄酮对照品的检出限在0.7813～4.6875×10-4mg/mL之间，加标回收率范围在93.40％～103.69％，且相对标准偏差均小于2％，说明该RP-HPLC-DAD分析方法科学可靠。
　　2.蜂胶酚类化合物的鉴定:采用RP-HPLC-ESI-MS/MS法对EaEP进行分离鉴定，通过分析EaEP经过HPLC分离的色谱峰的紫外(Ultraviolet，UV)光谱信息、对应母离子和二级质谱的碎片离子，并结合已知黄酮对照品共鉴定出26种酚类物质，包括7种酚酸，19种黄酮类化合物:其中，槲皮素、芹菜素、山奈酚、异鼠李素、白杨黄酮、松属素和高良姜素是经过与对照品比较相对保留时间，UV光谱，MS的碎片离子等鉴定出的;而木犀草素、短叶松素、7-甲氧基白杨素、5-甲氧基高良姜素、5-甲氧基短叶松素-3-乙酸酯、5-甲氧基短叶松素、7-甲氧基槲皮素、樱花素、短叶松素-3-乙酸酯、短叶松素-3-丙酸酯、短叶松素-3-异丁酸酯、短叶松素-3-O-戊酸酯、3，4-二甲氧基肉桂酸、咖啡酸异戊二烯酯、咖啡酸、咖啡酸苄酯、咖啡酸苯乙酯、对香豆酸苄酯、咖啡酸肉桂酯是分析质谱的裂解途径，并结合前人研究结果从而鉴定出的酚类物质。本研究建立的HPLC-ESI-MS/MS分析方法准确可靠，可以达到对蜂胶酚类物质定性、定量分离鉴定的目的;比较了中国12个地理源（选自暖温带、中温带、北亚热带、中亚热带、南亚热带、高原温带）EaEP液相色谱图总峰面积和7种典型黄酮总含量，发现湖北宜昌（北亚热带）、山西太原（暖温带）、浙江杭州（北亚热带）3个地理源EaEP中7种典型黄酮总含量和总峰面积比其他地理源的要高。
　　3.EaEP对S.mutans生长、产酸和粘附的影响:测定EaEP对S.mutans的最小抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentration，MIC），发现EaEP中7种黄酮总含量与MIC值成负相关，存在极显著(P=0.004＜0.01)量效关系，EaEP液相色谱图中总峰面积与MIC值也成负相关，量效关系极显著(P=0.004＜0.01)，说明EaEP中7种典型黄酮含量越高，酚类物质含量越高，对S.mutans生长的抑制作用越强，该地理源蜂胶的抗龋齿活性越强。测定EaEP对S.mutans产酸的抑制效果，结果显示EaEP中7种黄酮总含量与△pH值成极显著(P=0.005＜0.01)的正相关，EaEP液相色谱图总峰面积与△pH值具有极显著(P=0.006＜0.01)的正相关效应，说明蜂胶7种典型黄酮含量越高，酚类物质含量越高，对S.mutans产酸的抑制作用越强，即该地理源蜂胶的抗龋齿活性越强。测定EaEP对S.mutans在玻璃管壁粘附抑制效果和半抑制浓度(IC50)，结果显示EaEP对S.mutans粘附的抑制效果成非线性浓度效应关系，EaEP中7种黄酮总含量、总峰面积与IC50值均无相关性，说明EaEP中酚类物质含量以及7种黄酮总含量对S.mutans在玻璃管壁的粘附作用没有相关性。
　　4.EaEP对S.mutans细胞形态和结构的影响:通过扫描电镜和透射电镜观察，发现加入EaEP后的S.mutans与加入EaEP之前对比，细菌细胞表面变得粗糙，有黏状物产生，形状变得不规则，细胞壁被破坏，细胞膜通透性发生变化，细胞质出现泄漏，同时部分细胞细胞壁附近出现亮白色圆弧状物质;加入EaEP后对S.mutans的分裂也产生巨大影响，分裂中的细胞横膜不清晰，两个子细胞大小不一，且在分裂过程中两个子细胞就出现细胞壁被破坏，细胞质泄漏现象，说明EaEP对S.mutans的菌体结构及细胞分裂产生破坏，也在一定程度上解释了蜂胶的抗龋齿活性。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 前言

2 蜂胶的主要成分

2．1 蜂胶中的黄酮类化合物

2．2 蜂胶中的酚酸类化合物

3 蜂胶地域性研究

4 蜂胶对Streptococcus mutans的作用

5 论文研究内容

6 创新点

第二章 不同地理源蜂胶酚类物质的提取、分离和鉴定

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与讨论

2．1 不同溶剂蜂胶提取物对S．mutans体外粘附的抑制作用

2．2 EaEP的HPLC-DAD分析方法的建立

3 结论

第三章 不同地理源EaEP对S．mutans生长、产酸、粘附的影响

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 研究方法

2 结果与讨论

2．1 不同地理源EaEP对S．mutans生长的影响

2．2 不同地理源EaEP对S．mutans产酸的影响

2．3 不同地理源EaEP对S．mutans在试管壁粘附的影响

3 结论

第四章 扫描电镜和透射电镜观察EaEP对S．mutans菌体结构的影响

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2 结果与讨论

2．1 扫描电镜结果

2．2 透射电镜结果

3 结论

第五章 结论和展望

结论

展望

参考文献

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