绵羊MIR-148b和MIR-320对毛囊发育调控研究

摘要

MicroRNAs(miRNAs)是一类能够对基因进行广泛调节的非编码微小RNA，存在于真核生物体内。已有研究表明它们能够参与肿瘤形成、心脏发育、脂肪代谢、神经系统发育和细胞的增殖分化等过程。此外有证据表明miRNA会影响毛囊的发育和生长周期。本课题组前期利用Solexa测序检测了藏绵羊毛囊发育不同时期（休止期、生长期和衰退期）miRNAs的表达情况，试图筛选出对毛囊发育过程有重要作用的miRNAs。测序结果表明毛囊从休止期到生长期的发育过程中，miR-148b和miR-320属于上调表达倍数最高的一类miRNAs。为了进一步验证上述miRNA在毛囊发育过程中的具体作用及作用机制，本实验以人毛乳头细胞和人毛母质细胞为材料，在体外研究了miR-148b和miR-320对其增殖情况的影响，推断了miR-148b和miR-320在毛囊发育过程中的作用以及它们发挥作用可能涉及的信号通路。获得结果如下:
　　(1)Q-PCR的结果说明毛囊生长期miR-148b和miR-320的表达水平显著高于休止期的表达情况，这与前期的测序结果相符。
　　(2)miR-148b可促进人毛乳头细胞和人毛母质细胞的增殖，miR-320对人毛乳头细胞和人毛母质细胞的增殖有抑制作用。用miRNAminicis转染人毛乳头细胞和人毛母质细胞后发现，超表达miR-148b后利用Edu检测的增殖细胞比例显著高于对照组的(P＜0.05);而超表达miR-320后Edu检测的增殖细胞比例显著低于对照组的(P＜0.05)。另用xCELLigence系统实时监控系统检测证实超表达miR-148b后人毛乳头细胞的增殖速度显著高于对照组。
　　(3)miR-148b能显著提高Wnt信号通路的活性。TOPFlash/FOPFlash荧光素酶报告基因检测结果表明miR-148b能显著提高TOPFlash报告基因的荧光信号强度(P＜0.05)。
　　(4)超表达miR-148b能提高Wnt信号通路下游转录因子的表达水平，而miR-320会降低它们的表达水平。在人毛乳头细胞中超表达miR-148b和miR-320后检测β-catenin、cycD、c-jun和PPARD的mRNA的表达水平，结果表明相比于对照组，转染miR-148bminics能提高上述基因的表达情况，而转染miR-320minics则会降低上述基因的表达情况。
　　(5)miR-148b可能会靶作用于SMAD2、CAMK2A、NFAT5和Wnt10b来发挥对Wnt信号通路的调控作用。我们利用Targetscan对miR-148b的靶基因进行了预测和筛选，选取NFAT5、SMAD2、CAMK2A、PRICKL2、Wnt1和Wnt10B作为其候选靶基因;经过双荧光素酶报告基因载体系统验证，证实了miR-148b与SMAD2、CAMK2A、NFAT5和Wnt10b3'UTR的特异结合作用。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表(Abbreviation)

1 前言

1．1 问题由来

1．2 文献综述

1．2．1 miRNAs研究概述

1．2．2 miRNAs的研究方法和手段

1．2．3 毛囊发育相关miRNAs的研究进展

1．2．4 miR-320调控毛囊发育的研究进展

1．2．5 miR-148b的研究进展及其与毛囊发育的研究进展

1．2．6 Wnt信号通路与毛囊发育的研究进展

1．3 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 技术路线

2．2 实验试剂和设备

2．2．1 常用试剂

2．2．2 实验室常用设备

2．3 组织样品

2．4 菌株、载体和细胞

2．4．1 菌株

2．4．2 载体

2．4．3 细胞

2．5 细胞转染

2．5．1 转染方法

2．5．2 miRNA模拟物

2．6 RNA提取与检测

2．6．1 RNA提取

2．6．2 提取RNA的质量检测

2．7 quantitative(Q)-PCR

2．8 蛋白质免疫印迹技术(Western Blot)

2．8．1 试剂配制和耗材

2．8．2 蛋白样品收集

2．8．3 蛋白样品浓度测定

2．8．4 蛋白质免疫印迹

2．9 双荧光素酶报告基因系统检测miRNA与预测靶基因的结合位点

2．9．1 双荧光素酶报告基因系统的结构

2．9．2 双荧光素酶报告基因载体的构建

2．9．3 细胞内重组载体结合位点的验证

2．9．4 荧光素酶活性的检测

2．10 Wnt信号通路活性报告系统

2．10．1 Wnt信号通路活性报告系统的结构

2．10．2 PRL-TK载体结构

2．11 细胞增殖检测方法

2．11．1 Edu标记染色检测细胞增殖

2．10．2 xCELLigene细胞实时定量监控系统检测细胞增殖

2．11 生物信息学相关工具和网站

2．12 数据统计分析

3 结果

3．1 藏绵羊基因组miR-148b和miR-320的序列克隆

3．2 miR-148b和miR-320在藏绵羊毛囊发育不同时期的表达

3．3 miR-148b和miR-320对人毛囊细胞增殖的影响

3．3．1 Edu检测miR-148b和miR-320对人毛乳头细胞和人毛母质细胞细胞增殖的影响

3．2．2 用xCELLigence检测miR-148b和miR-320对人毛乳头细胞和人毛母质细胞细胞增殖的影响

3．3 miR-148b和miR-320对Wnt信号通路活性的影响

3．4 miR-148b和miR-320对β-catenin表达变化的影响

3．5 miR-148b和miR-320对Wnt通路下游转录因子表达的影响

3．6 miR-148b在毛囊发育过程中发挥作用的靶基因的预测与验证

3．6．1 miR-148b在毛囊发育过程中发挥作用的靶基因的预测

3．6．2 miR-148b在毛囊发育过程中重要靶基因的验证

4 讨论

4．1 miR-148b和miR-320对毛囊细胞增殖的影响

4．2 miR-148b和miR-320靶向调控Wnt信号通路的活性

4．3 miR-148b和miR-320在毛囊发育过程中的作用及其机制

5 小结

5．1 本研究的主要结果与结论

5．2 本研究的创新点

5．3 本研究的不足之处以及下一步工作建议

参考文献

致谢