香蕉(Musa spp.)体内草酸钙针晶体的生物矿化机制

摘要

植物中的草酸钙晶体在特化细胞（晶异细胞）内的形成，是一种基本的、重要的生理代谢过程。不同植物草酸钙晶体在形态或结构上存在多样性和种间专一性;同一种植物中的草酸钙晶体往往具有特定的尺寸和形貌，并且成核后晶体的生长和晶异细胞的发育间存在显著的协同作用，这些事实均表明草酸钙的生物矿化不是一种随机的化学结晶过程，而是受到生物大分子（蛋白、多糖、糖蛋白等）的精确调控。被塑造的矿化相在特定的膜包覆空间内经历了不同的生物化学途径，最终形成热力学稳定的晶相。生物体通过复杂的分子和生物化学机制调控生物矿化的形成，尤其是通过生物矿物内部的有机基质调控晶体的形貌和晶相。目前，虽然有一些关于植物体内促进晶体成核的基质蛋白的报道，但对香蕉（Musa spp.）晶异细胞内草酸钙针晶体的形成机制仍然不清楚。本文除介绍香蕉假茎中针晶异细胞和针晶体的形态和结构特征，钙对针晶体的调控机制外，主要研究针晶体生长过程的有机基质调节机制以及体外模拟相关生物分子对草酸钙结晶动力学过程的调控等，以期揭示植物体内草酸钙的生物矿化机制。
　　本研究主要内容包括：⑴香蕉中针晶体的形态特征及分布。在香蕉（Musa spp.）的假茎气腔中沉积针晶体的细胞通常是特化的晶异细胞。晶异细胞包含成束（200根以上）的草酸钙针晶体。借助高分辨场发射扫描电镜的观察发现单根针晶体为锥形六棱或八棱晶（宽约4μm，长约150μm）。X-射线衍射、傅里叶转换红外光谱、热失重及差热分析和拉曼光谱分析显示单根针晶体的晶相为—水合草酸钙。巴西蕉和泰国蕉来源于不同的国家但基因型相同，针晶体分布和晶体大小等特性相似，表明物种间遗传的稳定性。⑵Ca2+介导的Musa中针晶异细胞的形成。借助钙离子微电极的非损伤微测技术测定晶异细胞内外钙离子流时发现，钙离子的外流仅为正常薄壁细胞的1/8，表明晶异细胞对钙离子具有明显的高吸收低外排。此外，针晶异细胞和针晶体的大小随钙离子浓度的升高而增加，表明针晶体和晶异细胞是协同生长的，并且钙离子能够调控针晶体的生长。⑶与针晶体相连的有机基质。借助纳米级分辨的二次离子质谱技术，原位探测针晶体的元素分布时发现在针晶体外表面存在16O-和12C14N-二次离子，表明单根针晶体被一层有机膜所包覆（此膜可被丙酮所溶解，即定义为MA。此外，在原子力显微镜(AFM)下发现针晶体内存在自组装蛋白丝（直径约为9nm），此有机基质可溶于甲酸，故定义为MF。经LTQ-ESI-MS/MS确定MF蛋白的分子量为14 kDa。蛋白的C末端高度保守，且保守区域与一个细菌（DSM1728）的伴侣蛋白chaperone protein DnaJ相似。C末端的11个氨基酸具有双亲性并富含脯氨酸（PRP）且以无规卷曲的结构存在。⑷针晶体内自组装的纳米蛋白丝模板诱导伸长的草酸钙晶体的形成。化学合成的11-mer PRP在离体条件下也可自组装形成微米长的丝状结构，并可在其表面诱导形成伸长的草酸钙晶体。成核实验表明低浓度的11-mer PRP可促进草酸钙的成核，成核后形成的晶体与对照相比显著地伸长。与成核结果不同，AFM下原位直接观测表明11-mer PRP并不影响草酸钙(-101)和(010)晶面生长的动力学过程以及台阶形貌。⑸柔韧性草酸钙针晶体的自组装。AFM下原位溶解单根针晶体时发现六边形针晶体的(100)晶面上存在规则带状结构，每条带由直径约130nm的纳米球组成，而每个纳米球由四个65nm的小球构成。单根针晶体的断裂面厚度与带状结构的宽度接近。结合所有AFM下的原位观察结果得出埋藏在针晶体内的自组装蛋白丝调控纳米粒子有序堆砌，即纳米球围绕中心蛋白丝整齐排列并融合形成厚度相同的片层结构，这些片层结构垂直于蛋白丝长轴，最终形成锥形六棱针晶体。⑹专一性吸附抑制草酸钙的成核和生长。通常与草酸钙生物矿化相关的蛋白含有磷酸化位点。选取已报道的与植物草酸钙形成有关的收钙素蛋白并合成了相关短肽CS-1和它磷酸化的对应体(p)CS-1。体相成核实验表明(p)CS-1与CS-1相比，能够显著抑制草酸钙晶体的成核并改变晶体形貌。原位AFM直接观察也证实了(p)CS-1比CS-1对(-101)面台阶生长动力学和形貌影响更明显，这表明带负电的磷酸根和带正电的(-101)面的静电作用更强，从而提高了蛋白与晶面的吸附，进而显著地抑制草酸钙的生长。⑺综上所述，香蕉体内草酸钙针晶体形成机制的揭示，有助于理解在钙或草酸过剩的条件下，植物如何调控钙或草酸在有限的空间内形成独特形态和结构的针晶束，避免过高浓度的钙或草酸对植物造成伤害，使之适应环境并得以生存。

目录

声明

摘要

缩略语表

图目录

表目录

1 文献综述

1．1 草酸钙晶体的分布、形态和功能

1．1．1 草酸钙晶体的分布

1．1．2 植物中草酸钙晶体的形态

1．1．3 草酸钙晶体的功能

1．2 植物体内草酸钙晶体的形成

1．2．1 草酸生物合成和降解

1．2．2 钙的吸收和运输

1．2．3 草酸钙晶体在晶异细胞中合成

1．3 溶液中草酸钙的成核和生长

1．3．1 草酸钙结晶过程中的热动力学

1．3．2 成核

1．3．3 草酸钙溶液的成核动力学

1．4 草酸钙在离体条件下结晶的分子机制

1．5 有待解决的问题

2 课题研究的背景、内容和技术路线

2．1 课题研究的背景和意义

2．2 研究内容

2．3 技术路线

3 香蕉(Musa spp．)中针晶体的形态特征及分布

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验材料及培养

3．2．2 实验方法

3．3 数据处理

3．4 结果与分析

3．4．1 香蕉假茎和叶片的组织结构

3．4．2 香蕉中草酸钙晶体的类型和分布

3．5 讨论

3．5．1 草酸钙晶体的多样性

3．5．2 晶体的功能

3．6 小结

4 针晶异细胞的性质、晶体结构及钙离子对针晶体生长的调控机制

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验材料及培养

4．2．2 实验方法

4．3 数据处理

4．4 结果与分析

4．4．1 针晶异细胞的特性

4．4．2 假茎中针晶异细胞的特点

4．4．3 钙离子对针晶体生长的调控作用

4．4．4 活体染色表明钙在晶异细胞的内质网上富集

4．5 讨论

4．5．1 针晶异细胞的特性

4．5．2 钙对针状草酸钙晶体矿化的调控作用

4．6 小结

5 与针晶体相连的有机基质

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．2．1 实验材料及培养

5．2．2 实验方法

5．3 数据处理

5．4 结果与分析

5．4．1 调控针晶体生长的有机基质

5．4．2 针晶异细胞中存在的有机基质

5．4．3 有机基质中蛋白的信息

5．4．4 针晶体内蛋白的性质

5．5 讨论

5．5．1 晶异细胞中的基质结构

5．5．2 有机基质的功能划分

5．5．3 与针晶体相联的蛋白

5．6 小结

6 针晶体内自组装的纳米蛋白丝模板诱导伸长的草酸钙晶体的形成

6．1 引言

6．2 实验方法

6．2．1 六边形COM晶体的合成

6．2．2 调控晶体生长的功能肽段的选择

6．2．3 肽段合成

6．2．4 COM体外成核实验

6．2．5 11-mer PRP的自组装与矿化实验

6．2．6 AFM下COM的表面生长

6．3 数据处理

6．4 结果与分析

6．4．1 11-mer PRP肽段的自组装

6．4．2 11-mer PRP模板伸长的草酸钙晶体的形成

6．4．3 原位AFM观察11-mer PRP肽段对COM生长的影响

6．5 讨论

6．5．1 表面诱导和生物分子的自组装

6．5．2 过饱和溶液组分对有机分子-COM间的相互作用的影响

6．5．3 11-mer PRP与全长蛋白的关联

6．6 小结

7 柔韧性针晶体的自组装

7．1 引言

7．2 实验方法

7．2．1 原位AFM检测

7．2．2 SEM

7．2．2 EDTA对针晶体的原位溶解

7．3 数据处理

7．4 结果与分析

7．4．1 不同浓度EDTA对针晶体的溶解

7．4．2 经EDTA蚀刻的针晶体存在规则的纳米结构

7．4．3 针晶体的形成机制

7．4．4 基质蛋白赋予生物矿物针晶体良好的柔韧性

7．4．5 有膜与无膜针晶体外延生长的差异性

7．5 讨论

7．6 小结

8 专一性吸附抑制草酸钙的成核和生长

8．1 引言

8．2 实验方法

8．2．1 体外合成COM晶体

8．2．2 调控晶体生长的功能肽段的选择

8．2．3 肽段合成

8．2．4 COM体外成核实验

8．2．5 原位AFM检测

8．3 数据处理

8．4 结果与分析

8．4．1 不同本底电解质对晶体成核的影响

8．4．2 (p)CS-1和CS-1蛋白抑制COM晶体成核

8．4．3 微观和介观尺度下COM晶体的形貌

8．4．4 晶面上台阶的生长特点及速度测量方式

8．4．5 CS-1及(p)CS-1对台阶生长的影响

8．5 讨论

8．5．1 本底电解质的作用

8．5．2 COM晶体结构

8．5．3 (010)晶面上的台阶交错

8．5．4 CS-1在COM(-101)面上的专一性吸附

8．5 小结

9 全文总结与展望

9．1 主要结论

9．2 创新点

9．3 展望

参考文献

常用仪器型号及品牌

作者简介

博士期间发表文章

致谢