鸡毒支原体潜在保护性抗原三磷酸甘油醛脱氢酶的筛选与鉴定

摘要

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)，又称鸡毒霉形体或鸡败血支原体，是引起鸡慢性呼吸道病的病原菌，也是现代养鸡业最常见的病原之一，给养禽业带来了严重的经济损失。目前控制MG感染的主要措施是病原净化与疫苗接种。常用的疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗两种，灭活疫苗生产成本高，且不能阻止MG垂直传播;弱毒疫苗免疫力弱，存在毒力返强及感染非目标鸡群的风险，从而制约了这两种疫苗的使用，因此，亟需研发更安全高效的MG疫苗。而MG疫苗抗原的筛选是疫苗研发的关键和出发点，本研究基于机体局部特异性抗体在抗MG感染过程中尤为重要的事实，利用MG-HS感染鸡群呼吸道冲洗液中特异性抗体筛选相应的MG保护性抗原，并对候选抗原基因及其重组蛋白进行了研究。
　　本研究采用鸡毒支原体感染健康雏鸡，2w后采集血清和呼吸道冲洗液，分别用三种血清学方法进行抗体检测。其中，间接ELISA法用以区分黏膜抗体IgA和血清抗体IgY;血凝抑制试验和代谢抑制试验用以区分所产生的特异性抗体是否对鸡毒支原体的生长繁殖具有抑制作用，再以具有生长抑制作用的感染性抗体，定向筛选鸡毒支原体菌体表面的保护性抗原，取得了如下结果:
　　1.感染鸡呼吸道冲洗液中的IgY、IgA同为黏膜免疫抗体
　　鸡毒支原体通过滴鼻途径感染后，呼吸道冲洗液中产生了高效价的IgA抗体(OD450为1.11±0.06)，血清中则较低(OD450为0.46±0.09);IgY抗体在感染鸡的血清和气管冲洗液中均具有很高的抗体效价（OD450分别为2.47±0.17和0.72±0.08），说明鸡毒支原体感染后，刺激机体免疫系统产生了高效价的特异性血清抗体IgY，IgY不仅存在于血清中，而且也被分泌于黏膜表面，这种被分泌于黏膜面的IgY可能与IgA一起在黏膜免疫中共同发挥着抗感染作用。
　　2.感染鸡血清中的血凝抑制抗体(IgY)无代谢抑制作用
　　将感染组和对照组的血清和呼吸道冲洗液进行血凝抑制试验，检测其血凝抑制抗体，结果表明感染组中血清的平均血凝抑制价为1∶64，呼吸道冲洗液平均血凝抑制价为1∶2，对照组血清和呼吸道冲洗液均没有血凝抑制作用。代谢抑制试验结果表明，感染鸡呼吸道冲洗液的代谢抑制效价为6.63±0.95(log2，n=8)，远远高于血清的代谢抑制效价1.75±0.71(log2，n=8)(P＜0.01)。
　　3.感染鸡产生的黏膜抗体IgA对鸡毒支原体的生长和代谢有抑制作用
　　对感染鸡血清、气管冲洗液用三种血清学方法进行了抗体检测，结果可以看出，感染2w后，血凝抑制抗体大量出现于血清中，而气管冲洗液几乎检测不到;代谢抑制抗体仅在气管冲洗液中检出，血清中检测结果为阴性，这与黏膜抗体IgA大量存在于气管冲洗液、血清中较低的结果基本一致;IgY抗体则在血清和冲洗液中均能检出。这些结果表明:(1)感染后产生的血清抗体IgY亦可作为黏膜抗体与IgA一起出现于黏膜表面;(2)血清中的高效价的血凝抑制抗体（血凝素抗体）对鸡毒支原体的生长代谢无抑制作用;(3)感染鸡产生的黏膜抗体IgA对鸡毒支原体的生长和代谢有抑制作用，即特异性IgA所对应的抗原可能就是鸡毒支原体的保护性抗原。
　　4.三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)可能是鸡毒支原体的保护性抗原
　　以鸡毒支原体全菌体为抗原，感染鸡的呼吸道冲洗液为一抗，羊抗鸡IgA及IgY分别为二抗进行Western-blot分析，回收主要显色条带进行质谱分析和生物信息学相关分析。结果表明，感染鸡气管冲洗液中MG特异性抗体相对应的抗原成分有2个，一个为3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-p dehydrogenase，GAPDH)，大小为37KD，是一种糖代谢相关酶;另一个为VlhA4.12蛋白，大小为75KD，为血凝素家族中的成员。根据三种血清学检测结果(表4-3)综合分析，被筛选到的分子量大小为37KD的三磷酸甘油醛脱氢酶可能就是鸡毒支原体的一种保护性抗原;而VlhA4.12蛋白可能与我们以前报道的pMGA相关。
　　5.三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)及VlhA4.12蛋白的表达研究
　　利用分子生物学实验技术获得候选抗原基因，并对其中编码色氨酸的TGA进行突变后进行原核表达，并对表达产物活性进行鉴定。结果成功突变GAPDH和VlhA4.12基因中色氨酸编码子TGA，并进行了原核表达，表达产物均能与MG感染鸡的呼吸道冲洗液发生免疫学反应。但重组蛋白GAPDH(rGAPDH)免疫小鼠制备的免疫血清对MG没有生长/代谢抑制作用。
　　上述结果为进一步进行MG黏膜免疫机制研究拓展了新的思路，为MG免疫预防及亚单位疫苗的研发提供了新的靶标。

目录

声明

摘要

缩略语(Abbreviation)

1 前言

1．1 鸡毒支原体的概况

1．1．1 鸡毒支原体的研究历史

1．1．2 鸡毒支原体的病原学和流行病学

1．1．3 临床症状及病理变化

1．1．4 诊断及治疗

1．1．5 鸡毒支原体的预防

1．2 鸡毒支原体毒力因子研究

1．2．1 VlhA蛋白

1．2．2 GapA和CrmA

1．2．3 脂蛋白MslA

1．2．4 唾液酸酶

1．3 鸡毒支原体疫苗研究进展

1．3．1 鸡毒支原体灭活油乳剂疫苗

1．3．2 鸡毒支原体弱毒苗

1．3．3 生物技术疫苗

1．4 GAPDH蛋白

2 研究目的与意义

3 材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 试验动物

3．1．2 菌株、质粒

3．1．3 主要仪器

3．1．4 主要试剂

3．1．5 主要溶液和培养基

3．2 鸡毒支原体感染试验

3．2．1 鸡毒支原体HS菌株的复苏

3．2．2 鸡毒支原体HS株CCU的测定

3．2．3 鸡毒支原体HS菌株的浓缩

3．2．4 鸡毒支原体感染健康鸡群实验

3．2．5 鸡血清和呼吸道冲洗液抗体效价的测定

3．2．6 鸡血清和呼吸道冲洗液血凝抑制价的测定

3．2．7 鸡血清和呼吸道冲洗液的代谢抑制实验

3．3 目的蛋白的筛选

3．3．1 保护性抗原的筛选

3．3．2 潜在抗原的质谱分析

3．4 目的抗原的生物信息学分析

3．5 目的抗原重组蛋白

3．5．1 支原体基因组的提取

3．5．2 目的抗原基因的扩增

3．5．3 目的基因表达载体构建

3．5．4 色氨酸编码子TGA的定点突变

3．5．5 重组蛋白的表达

3．5．6 重组蛋白的纯化

3．5．7 纯化后蛋白的western-blot鉴定

3．6 rGAPDH多克隆抗体的制备及其MG代谢抑制(MI)作用

3．6．1 抗原的乳化

3．6．2 BALB／c小鼠的免疫

3．6．3 BALB／c小鼠的抗体检测

3．6．4 rGAPDH多克隆抗体对鸡毒支原体HS株的MI作用

4 结果与分析

4．1 鸡毒支原体感染鸡呼吸道冲洗液和血清中IgA和IgY检测

4．2 感染鸡血凝抑制试验和代谢抑制试验结果

4．2 保护性抗原的筛选与质谱分析

4．3 目的抗原生物信息学分析

4．3．1 GAPDH抗原表位预测

4．3．2 VlhA4．12抗原表位预测

4．3．3 三级结构相似性及其空间构像分析

4．4 GAPDH基因和VlhA4．12胞外区基因的克隆与表达

4．4．1 目的基因的克隆

4．4．2 重组蛋白的表达

4．5 GAPDH重组蛋白多抗血清的代谢抑制实验

5 讨论

6 结论

参考文献

致谢