嗜水气单胞菌感染后团头鲂肝脏组织的转录组分析

摘要

团头鲂（Megalobrama amblycephala），是一种重要的大宗淡水经济鱼类，近年来由于环境恶化、种质资源衰退等原因，抗病力降低，在养殖生产中易受到细菌感染，对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的感染尤为敏感，常引发细菌性败血症，造成大量死亡。本文以团头鲂为研究对象，对其注射嗜水气单胞菌后0h、4h、24h时刻采取肝脏组织，对其进行转录组学研究，并使用qRT-PCR技术对补体通路基因进行定量检测，之后分析并阐述了补体系统通路在团头鲂感染细菌后中的调控变化。主要研究结果如下：
　　1.成功构建了嗜水气单胞菌侵染后团头鲂肝脏3个转录组测序文库，并利用 Illumina HiSeq2500平台进行测序，获得33,692,775条raw reads，过滤后得到29,208,421条clean reads。经组装得到89,743条Unigene，平均长度781 bp，N50为1,365 bp，通过与Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG数据库比对，共鉴定出47,955（53.44％）条功能已知的Unigene序列。与 Nr库比对共得到29,010条蛋白序列，有23,283条（80.26%）是动物蛋白序列，其中鱼类又居大多数，斑马鱼序列（56.16%）最多。使用ESTscan软件预测得到了2,125个新的CDS序列。
　　2.从7,128条Unigene序列中开发得到8,250个SSR位点，其中二核苷酸重复类型的SSR有5,143个（占62.34%），Unigene中平均每8.5 kb出现一个SSR位点。从三个样本中共筛选出133,692个SNP和6,035个Indel，分布在20,350条Unigene上。
　　3.共筛选得到13,962条差异表达基因（DEG），其中0 h与4 h样本的 DEG数为10,583，4 h与24 h样本相比有3,741个DEG，0 h与24 h样本有8,813个DEG。对所有DEG的上下调关系进行统计发现，在感染后的0 h~4 h内，大部分（74.12%）DEG都是下调表达，在4 h~24 h时间段内，DEGs中上下调基因数几乎相同，而从整个0 h~24 h范围来看，DEGs中下调基因数占据了所有DEG数的72.18%。DEGs显著富集于43个 pathway，包括致病性大肠杆菌感染、金黄色葡萄球菌感染等多个疾病相关的通路，以及内质网上的蛋白加工、抗原加工和呈递、补体和凝血级联反应等多个免疫相关通路。GO富集分析得到16个Component Ontology、22个Function Ontology和33个Process Ontology，富集的Component Ontology主要与内质网等生物膜以及MHC蛋白复合体相关，Function Ontology与酶活性、抗原结合、铁离子结合、血红素结合等相关，Process Ontology与酶活性调节过程、抗原加工与呈递过程、T细胞、白细胞以及淋巴细胞介导的免疫过程、适应性免疫过程、细胞杀伤过程及小分子降解等过程相关。所有的 DEGs被划分为8个趋势，其中有4个显著富集的趋势。
　　4.荧光定量PCR结果显示补体通路基因的表达与转录组的分析结果基本吻合。鱼体在被感染后的0h到4h期间，补体的经典途径、旁路途径和凝集素途径均未被激活，之后的4 h到24 h期间，三条通路均处于激活状态。最后分析并阐述了团头鲂在受到细菌感染后三种补体途径的激活机制及补体系统在免疫中的作用。

目录

声明

缩略语表

第一章 前言

1 研究问题的由来

2 鱼类转录组学的研究进展

2.1 高通量测序技术的发展

2.2 转录组技术在鱼类研究中的应用

3 鱼类免疫相关基因及补体系统基因

3.1 鱼类免疫相关基因

3.2 补体系统基因

4 本研究的目的、内容及意义

第二章 材料与方法

1 实验材料

1.1 细菌感染实验

1.2 样品的采集及预处理

2 样品处理及测序

3 转录组学分析

3.1 组装及注释

3.2 分子标记开发

3.3 差异表达基因筛选及功能富集

3.4 差异表达基因的趋势聚类分析

4 补体系统基因的定量检测

4.1 qRT-PCR样品处理

4.2 qRT-PCR实验

4.3 定量数据分析

第三章 结果与分析

1 转录组测序结果统计

2 转录组分析结果

2.1 组装及注释结果

2.2 分子标记开发

2.3 差异表达基因筛选及功能富集

2.4 差异表达基因的趋势分析

3 补体系统基因表达的定量检测

3.1 肝脏组织总RNA提取

3.2 引物设计及筛选

3.3 补体系统基因表达的定量检测

3.4 补体通路的调节分析

第四章 讨 论

1 转录组统计结果

2 不同时刻表达模式差异

3 补体系统的调节

4 总 结

第五章 小 结

参考文献

致谢