水稻逆境诱导型启动子和低温应答基因OsLCL3的分离与鉴定

摘要

水稻是全世界最重要的粮食作物之一。干旱、高盐、高温和低温等非生物逆境制约着水稻的分布和产量，影响了农业生产的发展。研究植物的抗逆机制，一方面可以推动生物科学的发展，另一方面，通过研究抗逆应答中的一些重要基因和启动子，可以对水稻等粮食作物进行遗传改良，提高我国乃至世界粮食产量。
　　本研究包括两部分内容，一是从水稻中分离克隆逆境诱导型启动子，最终从多个候选启动子中鉴定受低温强烈诱导的启动子PC1和受干旱强烈诱导的启动子PD1;二是对低温应答基因OsLCL3的分离和鉴定，发现OsLCL3可能在水稻对低温的响应中起着重要作用。研究的主要结果如下:
　　1.用Real-time PCR的方法检测了5个候选启动子在逆境胁迫前后的表达量，发现4个启动子都受到相应逆境的诱导，其中有3个受到强烈地诱导;
　　2.对以上4个受逆境诱导的启动子的转基因材料进行了胁迫前后的GUS组织染色，发现其中2个启动子的材料在胁迫前后有显著差异;
　　3.对以上2个在胁迫前后有显著差异的启动子转基因材料进行了胁迫前后的GUS活性定量分析，发现这2个启动子的活性都受逆境强烈诱导，受低温强烈诱导的启动子为PC1，受干旱强烈诱导的启动子为PD1;
　　4.对PC1和PD1进行了序列分析，发现PC1序列中有低温响应元件LTRE等逆境顺式作用元件，PD1序列中有干旱响应元件DRE等逆境顺式作用元件;
　　5.克隆了受低温强烈诱导的启动子PC1的基因，命名为OsLCL3。对OsLCL3蛋白序列进行同源分析发现它属于DUF761超家族。系统树分析的结果显示OsLCL3蛋白在草本类单子叶植物中比较保守;
　　6.利用水稻原生质体瞬时表达系统对OsLCL3蛋白进行了亚细胞定位分析，初步确定了OsLCL3蛋白在细胞核和细胞质中都有定位;
　　7.将OsLCL3基因在水稻中超量表达，并对转基因植株进行低温胁迫处理，发现超量表达植株在低温胁迫下的电导率显著低于野生型对照植株，胁迫后超量表达植株的存活率显著高于野生型对照植株，表明OsLCL3在水稻对低温胁迫的响应和抵抗中起着重要作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 植物非生物逆境胁迫

1．2 非生物逆境诱导型启动子

1．2．1 植物中不同类型的启动子的分离和应用

1．2．2 植物中非生物逆境诱导型启动子的分离和应用

1．2．3 非生物逆境诱导型启动子的序列结构特征

1．3 水稻耐低温功能基因

1．4 本研究的目的和意义

2 材料方法

2．1 水稻材料、菌株及载体

2．2 候选启动子和候选基因

2．3 引物

2．4 载体构建与水稻的遗传转化

2．4．1 载体构建

2．4．2 水稻遗传转化

2．5 候选启动子基因表达量分析的材料准备

2．6 基因表达分析

2．7 GUS活性分析

2．7．1 GUS染色

2．7．2 GUS定量分析

2．8 转基因水稻植株的苗期低温胁迫处理

2．9 细胞膜透性测定

2．10 亚细胞定位分析

2．11 生物信息学分析

3 结果与分析

3．1 水稻逆境诱导型启动子的分离与鉴定

3．1．1 候选启动子汇总

3．1．2 Real-time PCR验证候选启动子受逆境诱导的情况

3．1．3 候选启动子的序列分析

3．1．4 候选启动子的转基因材料的组织GUS染色

3．1．5 候选启动子的逆境诱导GUS活性

3．2 水稻低温应答基因OsLCL3(PC1)的分离与鉴定

3．2．1 OsLCL3属于DUF761超家族

3．2．2 OsLCL3定位于细胞核和细胞质

3．2．3 超量表达OsLCL3可以提高转基因植株的耐低温能力

4 讨论

4．1 逆境诱导型启动子的探讨

4．1．1 候选启动子的选择

4．1．2 启动子的调控机理

4．1．3 启动子的应用

4．2 OsLCL3基因的功能探讨

4．2．1 OsLCL3与其他DUF761超家族蛋白亚细胞定位的相似性

4．2．2 OsLCL3参与植物对低温的应答与防御的可能机制

4．2．3 OsLCL3后续工作的开展

参考文献

致谢

附录

作者简介