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蜡梅转录因子基因ANL2的克隆和功能探究

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摘要

1 前言

1.1 植物转录因子的研究进展

1.1.1 植物转录因子的发现和概念

1.1.2 植物转录因子的结构

1.1.3 植物转录因子的分类

1.2 植物转录因子HD-ZIP的研究概况

1.2.1 植物转录因子HD-ZIP的来源

1.2.2 植物转录因子HD-ZIP的结构和分类

1.3 植物转录因子ANL2的研究概况

1.4 研究目的、内容及意义

1.5 技术路线

2 蜡梅转录因子基因ANL2的克隆和序列分析

2.1 前言

2.2 材料和方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.3.1 蜡梅花朵RNA质量的检测

2.3.2 CpANL2全长克隆

2.3.3 CpANL2的生物信息学分析

3 蜡梅CpANL2基因表达量分析

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.2.1 材料、仪器和试剂

3.2.2 实验方法

3.3 结果与分析

3.3.1 蜡梅花RNA质量检测

3.3.2 实时定量PCR实验结果

4 蜡梅CpANL2基因植物双元表达载体的构建和农杆菌转化

4.1 材料和方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 试剂和仪器

4.1.3 实验方法

4.2 结果与分析

4.2.1 CpANL2-pCAMBIA2300表达载体的构建

4.2.2 CpANL2-pCAMBIA2300重组质粒转化农杆菌

5 CpANL2的遗传转化研究

5.1 材料和方法

5.1.1 实验材料

5.1.2 试剂和仪器

5.1.3 实验方法

5.2.1 农杆菌介导法转化拟南芥

5.2.2 农杆菌介导法转化烟草

6 结论与讨论

6.1 蜡梅CpANL2的克隆

6.2 蜡梅CpANL2基因的序列和蛋白质生物信息学分析

6.3 蜡梅CpANL2表达量分析

6.4 蜡梅CpANL2基因植物双元表达载体的构建和农杆菌转化

6.5 蜡梅CpANL2基因功能探究

7 总结与展望

参考文献

致谢

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摘要

蜡梅(Chimonanthus praecoxL.),是蜡梅科蜡梅属的一种观赏性极强的树种,素以于寒冬腊月傲雪盛放而名,花朵颜色淡雅,花香扑鼻,沁人心脾。在蜡梅的研究中,蜡梅品种分为素心蜡梅品种群、晕心蜡梅品种群和红心蜡梅品种群,其中素心蜡梅花朵通体黄色,清新淡雅,而红心蜡梅内被片呈紫红色,中被片和外被片呈淡黄色,总体色彩层次有致,观赏性极高。在拟南芥中,ANL2转录因子调控拟南芥叶片和茎中花青素的分布,蜡质的合成以及根部细胞发育。
  本文对蜡梅ANL2转录因子进行探究,克隆到ANL2的全长片段,构建植株双元表达载体pCAMB IA2300-CpANL,农杆菌介导法浸染拟南芥野生型、拟南芥突变体和烟草,得到转基因植株,对转基因植株的表型进行研究和分析。主要研究结果如下:
  1.筛选转录组库中的ANL2转录因子,克隆其全长,进行生物信息学分析,包括保守结构域分析,系统进化分析和蛋白质预测,命名为CpANL2。
  2.提取素心蜡梅和红心蜡梅不同花期的RNA,反转录成cDNA,通过实时定量PCR测定CpANL2在不同蜡梅品种、不同花期和花朵不同部位的表达量差异。通过研究结果的分析,推测CpANL2可能调控类黄酮代谢通径中影响槲皮素合成的上游基因的表达,进而影响花青素的合成。
  3.构建CpANL2-pCAMBIA2300植物双元表达载体,通过热激法将目的基因转入农杆菌GV3101中。采用花序浸染法浸染野生型拟南芥,获得T1代阳性植株6株,T2代阳性植株40株,随机选取24株,提取DNA检测,全部为阳性植株。采用花序侵染法侵染突变体拟南芥,得到T1代植株30株,随机选取23株,提取DNA检测,得到阳性植株21株。采用叶盘法浸染烟草,随机选24株烟草抗性苗,提取DNA,经PCR检测得到20株呈阳性的转基因植株。
  4.野生型拟南芥超量表达获得的阳性植株,通过表型观察,发现T1代植株叶片表面较野生型相比颜色深,茎干都呈现紫红色,且有一株阳性植株叶片和茎干都呈现紫红色,T2代阳性植株中叶柄和茎干都呈现紫红色;突变体拟南芥阳性植株中发现有2株叶片背面呈现紫红色,叶片正面颜色也较未转化植株深,同时,阳性植株茎干颜色与野生型相同,呈现紫红色,而未转化植株则呈现绿色,说明CpANL2可以恢复拟南芥突变体茎干颜色的表型,总体表明CpANL2在花青素的合成和分布方面有一定作用。

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