蜡梅转录因子基因ANL2的克隆和功能探究

摘要

蜡梅（Chimonanthus praecoxL.），是蜡梅科蜡梅属的一种观赏性极强的树种，素以于寒冬腊月傲雪盛放而名，花朵颜色淡雅，花香扑鼻，沁人心脾。在蜡梅的研究中，蜡梅品种分为素心蜡梅品种群、晕心蜡梅品种群和红心蜡梅品种群，其中素心蜡梅花朵通体黄色，清新淡雅，而红心蜡梅内被片呈紫红色，中被片和外被片呈淡黄色，总体色彩层次有致，观赏性极高。在拟南芥中，ANL2转录因子调控拟南芥叶片和茎中花青素的分布，蜡质的合成以及根部细胞发育。
　　本文对蜡梅ANL2转录因子进行探究，克隆到ANL2的全长片段，构建植株双元表达载体pCAMB IA2300-CpANL，农杆菌介导法浸染拟南芥野生型、拟南芥突变体和烟草，得到转基因植株，对转基因植株的表型进行研究和分析。主要研究结果如下:
　　1.筛选转录组库中的ANL2转录因子，克隆其全长，进行生物信息学分析，包括保守结构域分析，系统进化分析和蛋白质预测，命名为CpANL2。
　　2.提取素心蜡梅和红心蜡梅不同花期的RNA，反转录成cDNA，通过实时定量PCR测定CpANL2在不同蜡梅品种、不同花期和花朵不同部位的表达量差异。通过研究结果的分析，推测CpANL2可能调控类黄酮代谢通径中影响槲皮素合成的上游基因的表达，进而影响花青素的合成。
　　3.构建CpANL2-pCAMBIA2300植物双元表达载体，通过热激法将目的基因转入农杆菌GV3101中。采用花序浸染法浸染野生型拟南芥，获得T1代阳性植株6株，T2代阳性植株40株，随机选取24株，提取DNA检测，全部为阳性植株。采用花序侵染法侵染突变体拟南芥，得到T1代植株30株，随机选取23株，提取DNA检测，得到阳性植株21株。采用叶盘法浸染烟草，随机选24株烟草抗性苗，提取DNA，经PCR检测得到20株呈阳性的转基因植株。
　　4.野生型拟南芥超量表达获得的阳性植株，通过表型观察，发现T1代植株叶片表面较野生型相比颜色深，茎干都呈现紫红色，且有一株阳性植株叶片和茎干都呈现紫红色，T2代阳性植株中叶柄和茎干都呈现紫红色;突变体拟南芥阳性植株中发现有2株叶片背面呈现紫红色，叶片正面颜色也较未转化植株深，同时，阳性植株茎干颜色与野生型相同，呈现紫红色，而未转化植株则呈现绿色，说明CpANL2可以恢复拟南芥突变体茎干颜色的表型，总体表明CpANL2在花青素的合成和分布方面有一定作用。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 植物转录因子的研究进展

1．1．1 植物转录因子的发现和概念

1．1．2 植物转录因子的结构

1．1．3 植物转录因子的分类

1．2 植物转录因子HD-ZIP的研究概况

1．2．1 植物转录因子HD-ZIP的来源

1．2．2 植物转录因子HD-ZIP的结构和分类

1．3 植物转录因子ANL2的研究概况

1．4 研究目的、内容及意义

1．5 技术路线

2 蜡梅转录因子基因ANL2的克隆和序列分析

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 结果与分析

2．3．1 蜡梅花朵RNA质量的检测

2．3．2 CpANL2全长克隆

2．3．3 CpANL2的生物信息学分析

3 蜡梅CpANL2基因表达量分析

3．1 前言

3．2 材料和方法

3．2．1 材料、仪器和试剂

3．2．2 实验方法

3．3 结果与分析

3．3．1 蜡梅花RNA质量检测

3．3．2 实时定量PCR实验结果

4 蜡梅CpANL2基因植物双元表达载体的构建和农杆菌转化

4．1 材料和方法

4．1．1 实验材料

4．1．2 试剂和仪器

4．1．3 实验方法

4．2 结果与分析

4．2．1 CpANL2-pCAMBIA2300表达载体的构建

4．2．2 CpANL2-pCAMBIA2300重组质粒转化农杆菌

5 CpANL2的遗传转化研究

5．1 材料和方法

5．1．1 实验材料

5．1．2 试剂和仪器

5．1．3 实验方法

5．2．1 农杆菌介导法转化拟南芥

5．2．2 农杆菌介导法转化烟草

6 结论与讨论

6．1 蜡梅CpANL2的克隆

6．2 蜡梅CpANL2基因的序列和蛋白质生物信息学分析

6．3 蜡梅CpANL2表达量分析

6．4 蜡梅CpANL2基因植物双元表达载体的构建和农杆菌转化

6．5 蜡梅CpANL2基因功能探究

7 总结与展望

参考文献

致谢