恶臭假单胞菌的培养优化及冷风干燥工艺的研究

摘要

石油污染的生物修复是当前的研究热点，石油降解菌大部分属于革兰氏阴性菌。然而，革兰氏阴性菌普遍存在不耐干燥，不耐保藏的问题，这限制了革兰氏阴性菌菌剂的产品化及其应用。假单胞菌属于革兰氏阴性菌，在生物修复、生物转化、生物防治等领域有广阔的应用前景。
　　本文以一株能降解石油的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）J7为研究对象，分别从培养基优化、干燥方法的选择、冷风干燥制备活菌粉工艺的优化、协同菌株的选择及其对模拟含油湖水修复等方面展开研究。具体研究结果如下:
　　(1)研究完成了恶臭假单胞菌J7培养基成分的优化。分别对碳源、氮源、无机盐采用单因素及正交试验，优化得到恶臭假单胞菌的培养基配方为:葡萄糖6g/L、酵母粉12g/L、MgSO4·7H2O3.5g/L、KH2PO42.5g/L、CaCl21.5g/L，培养后OD600为10.71，活菌数达到2.15×1010CFU/mL，达到国内最高培养水平。
　　(2)研究了冷风干燥制备恶臭假单胞菌菌粉的工艺。分别研究了不同载体与浓缩菌液混合比下的冷风干燥曲线，以及成品菌粉含水率、载体、载体预处理、保护剂对冷风干燥制备恶臭假单胞菌菌粉的干燥存活率及保藏稳定性的影响。优化后的冷风干燥制备工艺为:复合载体为硅藻土和碱处理玉米芯粉，质量比为1∶2，载体与浓缩菌液混合比为1∶2，保护因子（W/W)为甘露醇7％、谷氨酸钠5％、甘油1％，成品含水率控制在7％以下。干燥菌粉活菌数达1.03×1011CFU/g，干燥存活率74.63％，显著高于喷雾干燥(23.95％)，说明冷风干燥是一种适合恶臭假单胞菌干燥的技术。优化工艺制备的冷风干燥菌粉，保藏稳定性显著提高。室温保藏150d活菌数为2.13×109CFU/g，而未优化的对照组菌粉，室温保藏90 d活菌数仅为3.26×108CFU/g;4℃保藏条件下，对照组菌粉活菌数为1.84×1010CFU/g，优化组活菌数为3.36×1010CFU/g，提高将近1倍。
　　(3)初步研究石油降解菌剂的应用。筛选出与恶臭假单胞菌J7协同降解的菌株为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）Y11、地衣芽孢杆菌（Baclicus lincheniformis）B36。在含油湖水摇瓶体系中，对比单一菌株，混合菌株石油降解率提高13.0％。添加有机营养剂比无机营养剂更利于石油微生物降解，降解率提高15.2％，且降解体系C/N为20∶1时较适。静态模拟的含油湖水体系中，投加混合菌株及有机营养剂能使石油降解效率从20.1％提高到56.6％。且投加制备的石油降解菌菌粉的处理组，依然保持相当的石油去除率(54.7％)。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 石油污染的概况

1．2 石油降解菌及特征

1．3 革兰氏阴性菌在石油修复中的应用概况

1．4 革兰氏阴性菌菌剂制备及贮藏性能的研究现状

1．4．1 液态菌剂

1．4．2 冻干菌粉

1．4．3 微胶囊菌剂

1．4．4 载体吸附菌剂

1．5 影响菌剂贮藏稳定性的因素

1．5．1 菌株状态

1．5．2 成品菌剂含水率

1．5．3 保藏温度与时间

1．5．4 载体

1．5．5 保护剂

1．5．6 其他保藏条件

1．6 干燥技术及适用性

1．7 冷风干燥

1．7．1 冷风干燥技术

1．7．2 冷风干燥设备工作原理

1．8 假单胞菌的研究及应用现状

1．8．1 假单胞菌的培养及发酵现状

1．8．2 假单胞菌菌剂制备的概况及困难

1．8．3 假单胞菌的应用前景

1．9 研究的目的与意义

2 材料与方法

2．1 菌株

2．2 主要培养基

2．3 药品与材料

2．4 仪器设备

2．5 恶臭假单胞菌的培养基优化

2．5．1 菌种活化和种子液制备

2．5．2 基础培养基的选择

2．5．3 生长曲线的测定

2．5．4 碳源优化

2．5．5 氮源优化

2．5．6 无机盐正交优化

2．5．7 培养基成分正交优化

2．6 恶臭假单胞菌菌粉制备工艺研究

2．6．1 不同培养阶段菌体保藏稳定性的比较

2．6．2 浓缩菌悬液的制备

2．6．3 不同干燥方法的比较

2．6．4 恶臭假单胞菌的冷风干燥工艺研究

2．7．1 协同菌株的选择

2．7．2 营养添加剂及其比例

2．7．3 静态处理模拟含油湖水

2．8 测定方法

2．8．1 菌浓度的测定

2．8．2 活菌数的测定

2．8．3 pH的测定

2．8．4 含水量的测定

2．8．5 载体吸水能力的测定

2．8．6 氮源含氮量的测定

2．8．7 原油的前处理

2．8．8 原油含量的测定

3 结果与分析

3．1 恶臭假单胞菌培养基优化结果与分析

3．1．1 三种基础培养基对J7增菌的影响

3．1．2 J7生长曲线及各时期活菌数与OD600的关系

3．1．3 碳源筛选的结果

3．1．4 葡萄糖含量优化的结果

3．1．5 氮源筛选的结果

3．1．6 酵母粉含量优化的结果

3．1．7 无机盐正交试验的结果

3．1．8 培养基正交试验的结果

3．2 恶臭假单胞菌菌粉制备工艺研究结果

3．2．1 不同培养阶段菌体保藏稳定性的比较结果

3．2．2 不同干燥方法的比较结果

3．2．3 不同载体与浓缩菌液混合比的物料冷风干燥曲线

3．2．4 成品含水率对菌粉干燥保藏的影响

3．2．5 不同载体的特性及其对菌粉干燥保藏的影响

3．2．6 玉米芯粉预处理的效果及菌粉的干燥保藏影响

3．2．7 保护剂的筛选结果

3．2．8 载体配比与保护剂的正交试验结果

3．2．9 优化配方下菌粉保藏稳定性情况

3．3 菌株处理含油湖水的初步研究结果

3．3．1 协同菌株的选择及含油湖水摇瓶降解效果

3．3．2 营养添加剂及其比例对混合菌株摇瓶处理含油湖水的影响

3．3．3 混合菌株处理模拟含油湖水的效果

4 小结与讨论

4．1 恶臭假单胞菌的液体培养优化

4．2 恶臭假单胞菌的冷风干燥工艺研究

4．3 石油降解菌剂的应用初步研究

参考文献

攻读硕士期间的学术成果

致谢