马铃薯-茄子体细胞杂种遗传组分分析及青枯病抗性评价

摘要

原生质体融合技术是远缘物种间优良性状转移的重要技术之一，在改良栽培种抗性、细胞质替换等应用中具有独特的优势。在马铃薯中这一技术的应用能转移马铃薯野生种和近缘种的有利性状，创制新种质，改善目前栽培马铃薯遗传资源狭窄的状况。本研究以前期实验室创制的马铃薯和茄子非对称原生质体融合的50个再生株系(St8/Sm508.1(20'))和对称融合的103个再生株系(St142/Sm508.3)为研究材料，通过双亲特异的SSR标记确定杂种及其遗传组分，并对非对称融合体细胞杂种的青枯病抗性及农艺性状进行评价，为其利用提供理论和材料基础。主要研究结果如下:
　　1.融合亲本的特异SSR标记筛选。研究用已报道的有染色体定位信息的SSR引物369对（其中马铃薯133对，茄子236对），对包含融合亲本在内的9个马铃薯和7个茄子基因型进行特异标记筛选。369对引物中，144对引物在马铃薯中有特异带，214对引物在茄子中有特异带。在具有马铃薯特异带的引物中，48对引物有马铃薯染色体的定位信息，其余96对引物为茄子SSR引物在本研究马铃薯基因型中有特异带;204对茄子SSR引物在茄子亲本中有染色体定位信息。在茄子具有特异带的引物中，有96对引物在马铃薯和茄子中同时具有特异带。
　　2.非对称体细胞杂种鉴定与分析。首先利用茄子亲本特异的SSR引物对非对称融合再生株系进行鉴定，结果显示，50个融合子有42个携带茄子特异SSR标记，表明其为体细胞杂种。其中40个杂种进行了倍性鉴定，显示四倍体杂种有32个，其余8个杂种除1个为八倍体外，其它7个均为混倍体或非整倍体。32个茄子特异SSR引物在杂种中检测到44个位点，平均每个体细胞杂种插入2.9个位点。这些插入的茄子片段分布在茄子的12条染色体上，其中4号染色体的特异位点多达10个，其它染色体为1-4个不等。
　　3.非对称体细胞杂种的农艺性状和植物学性状观察。研究采用试管苗网室钵载观察了体细胞杂种部分植物性性状。观察显示，四倍体杂种生长基本正常，但倍性异常的杂种生长受到明显阻滞，如混倍体St8/Sm508.1(20')-6-1、St8/Sm508.1(20')-11-1.1，非整倍体St8/Sm508.1(20')-20-1，以及3号愈伤的3个丛生芽St8/Sm508.1(20')-3-1.30、St8/Sm508.1(20')-3-1.37、St8/Sm508.1(20')-3-1.52等。在体细胞杂种中观察到现蕾的杂种有12个，正常开花的2个(St8/Sm508.1(20')-10-5和St8/Sm508.1(20')-18-3），其中St8/Sm508.1(20')-10-5形成了浆果，但没有种子。结薯性观察显示，31个体细胞杂种能够正常结薯，薯形与马铃薯亲本相比变异程度较大，且均表现为薯形变长。薯块贮藏65天后观察发芽情况显示，除5个杂种块茎未发芽外，其余杂种均能够正常发芽。
　　4.体细胞杂种青枯病抗性鉴定。通过室内伤根接种的方法对32个四倍体非对称杂种进行了青枯病抗性评价，抗感性采用相对病情指数和多重比较(Duncan法)对杂种的抗性进行分析，分析结果显示，32个非对称杂种中没有抗性超过或者与亲本抗性全部相同的杂种系，但有6个体细胞杂种的相对抗病指数分析显示与抗病亲本没有显著差异，其余杂种中，17个杂种与马铃薯亲本抗性一致，还有5个中感杂种和4个高感杂种。中抗青枯病的杂种占19％，证明非对称原生质体融合可以较高频率地将茄子的抗性性状导入到体细胞杂种中，创制马铃薯新的抗青枯病遗传资源。
　　5.青枯病抗性与茄子插入片段的相关性分析。分析不同青枯病抗性级别的体细胞杂种所检测到的茄子标记显示，共有3个标记(emk03O04 locus1(Chr4)、emi04P17(Chr6)和emd13E02a locus1(Chr6))是在3个(St8/Sm508.1(20')-3-1.30、St8/Sm508.1(20')-3-1.52和St8/Sm508.1(20')-18-3)抗病体细胞杂种中特有的，推测这3个位点所在的茄子染色体片段可能携带有与青枯病抗性相关的基因。进一步对位点侧翼序列的编码蛋白在数据库中比对，发现标记emk03O04 locus1和emd13E02a locus1的侧翼序列均与马铃薯野生种Solanum demissum的Gag-pol多聚蛋白和逆转录转座子蛋白有关，而这类蛋白主要参与植物抗性调控过程，暗示携带茄子青枯病抗性可能与这2个标记所在的染色体片段所含的某些基因位点有关。
　　6.马铃薯-茄子对称融合共鉴定到84个体细胞杂种，检测到来源于茄子的特异SSR位点50个，马铃薯的特异SSR位点59个，杂种中检测到的双亲特异位点的比例基本为1∶1。体细胞杂种对双亲特异位点的保留率差异较大，马铃薯位点的保留率为49.6％，茄子位点的保留率为9.5％，结果表明本研究的对称融合中更倾向于保留马铃薯的遗传信息。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 课题提出

1．2 前人研究进展

1．2．1 植物体细胞杂种创新种质资源的应用概况

1．2．2 体细胞杂种的遗传组分研究

1．2．3 植物青枯病抗性遗传分析

1．3 本研究目的与内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 马铃薯融合亲本

2．1．2 茄子融合亲本

2．1．3 非对称融合再生株系

2．1．4 对称融合再生株系

2．2 实验方法

2．2．1 试管苗的培养与繁殖

2．2．2 田间种植

2．2．3 农艺性状观测与统计

2．2．4 植物基因组DNA提取

2．2．5 SSR分子标记组分鉴定

2．2．6 青枯病抗性鉴定

2．2．7 性状与标记的相关性分析

2．2．8 插入片段的侧翼序列生物信息学分析

3 结果与分析

3．1 体细胞融合亲本特异标记筛选

3．1．1 DNA质量检测

3．1．2 融合亲本特异标记的筛选

3．2 马铃薯-茄子(St 8#Sm508．1(20’))非对称融合杂种分析

3．2．1 体细胞杂种的遗传组分

3．2．2 体细胞杂种的植株性状观察

3．2．3 体细胞杂种的遗传组分、倍性异常与田间表型的相关性分析

3．2．4 体细胞杂种的青枯病抗性及与遗传组分的相关性分析

3．2．5 抗性相关序列的生物信息学分析

3．3 马铃薯-茄子对称融合杂种分析

3．3．1 再生植株的杂种鉴定(St142／Sm508．3)

3．3．2 体细胞杂种遗传组分分析

4 讨论

4．1 体细胞杂种的遗传组分

4．2 体细胞杂种植物学性状与倍性异常、分子标记的相关性

4．3 体细胞杂种的青枯病抗性以及抗性相关标记研究

4．4 对称原生质体融合与非对称原生质体融合的比较分析

4．5 育种潜质的选择

4．6 研究展望

参考文献

在读期间已发表和拟发表的论文

附录

致谢