斯钙素1在镉诱导牛肾细胞中的抗凋亡作用研究

摘要

斯钙素1(STC-1)是一种糖蛋白激素，在哺乳动物体内的多种器官组织都有分布与表达，属于多效因子。STC-1可以通过肠道与肾脏调节钙磷代谢。在肾脏中，主要是通过抑制钙的吸收，同时增加磷的重吸收来调节钙磷稳态。在多种细胞组织中的研究表明，STC-1还具有抗凋亡的作用，分子机制尚存在争议。镉是一种有蓄积性毒性的重金属元素。人的镉中毒已经受到普遍关注，然而对哺乳动物的镉中毒研究还很缺乏。与人相比，哺乳动物的镉中毒具有高耐受性和隐蔽性的特点。镉的主要蓄积部位是动物肾脏并引起肾脏损伤。因此，研究镉作用细胞后，STC-1在其中的相关作用，为STC-1功能研究提供参考，另外，研究STC-1对镉诱导牛肾细胞（MDBK细胞）的作用还可以有助于保障哺乳动物健康和规范动物食品安全检测。
　　本实验对牛肾细胞（MDBK细胞）进行培养，在细胞对数生长期添加氯化镉处理，通过荧光定量PCR与Western-Blot方法对STC-1的基因与蛋白的表达量进行测定。通过添加定量氯化镉和不同浓度的人斯钙素(hSTC-1)重组蛋白处理细胞，检测凋亡基因Caspase3、Bcl-2和解偶联蛋白2(UCP-2)的mRNA表达量变化，流式细胞仪检测细胞凋亡率和活性氧(ROS)产生量，结果如下:
　　1.镉对牛肾细胞STC-1 mRNA和蛋白表达的影响
　　通过不同浓度的镉处理细胞:STC-1基因有不同程度的上调并具有明显的剂量与时间依赖性。2h后，STC-1表现为上调显著，其中，20μg/mL镉诱导细胞8h后，与对照组相比，STC-1基因表达量是对照组的53倍，差异极显著，即(P＜0.01)，30μg/mL和50μg/mL组上调26和16倍，差异显著(P＜0.05)。
　　通过定量镉处理细胞:STC-1蛋白表达量上调明显并随时间延长上调越明显，2h组、4h组、8h组和12h组与对照组相比STC-1蛋白上调1.6、17、26.1和26.2倍。
　　2.hSTC-1重组蛋白对镉诱导的细胞凋亡过程的影响
　　通过定量镉与不同浓度hSTC-1重组蛋白共同处理细胞:有hSTC-1重组蛋白共同处理的实验组与只有定量镉处理的对照组相比，Caspase-3、Bcl-2和UCP-2基因有明显的表达量变化。实验组的Caspase-3表现为下调，其中，4h后，0.5μM和2μM组基因下调为对照组的0.11和0.18倍，差异显著，即(P＜0.05)，8h后，0.5μM和2μM组基因下调为对照组的0.13和0.24倍，差异显著，即(P＜0.05)。实验组的Bcl-2表现为上调，其中，2h后，0.5μM组基因上调为对照组的3.2倍，差异显著，即(P＜0.05)，4h后，0.5μM组基因上调为对照组的2.4倍，差异显著，即(P＜0.05)。实验组的UCP-2表现为上调，2μM组基因上调为对照组的1.9倍，差异显著，即(P＜0.05)，8h后，0.5μM组基因上调为对照组的3倍，差异显著，即(P＜0.05)。因此，hSTC-1重组蛋白在镉诱导细胞凋亡过程中，早期上调Bcl-2和UCP-2明显，晚期下调Caspase-3明显，作用浓度为0.5μM-2μM。
　　通过定量镉与不同浓度hSTC-1重组蛋白共同处理细胞:0.5、2、10μM hSTC-1重组蛋白处理的实验组的早期凋亡率分别为8.39％、4.23％和4.64％，细胞ROS产生量的平均值分别为9.88、3.53和8.58，与对照组早期凋亡率13.95％和ROS产生量的平均值19.8相比，说明hSTC-1重组蛋白可以明显抑制凋亡与ROS产生，作用浓度2μM-10μM。
　　结论:镉诱导细胞凋亡中STC-1基因蛋白表达上调显著，提示可以参考STC-1表达量来判断镉的蓄积情况。hSTC-1重组蛋白可以有效抑制镉诱导的细胞凋亡，分子机制包括凋亡早期Bcl-2表达和UCP-2基因的表达，凋亡晚期时抑制促凋亡基因Caspase-3表达并抑制ROS的产生。本实验为进一步研究STC-1生物功能提供参照。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表(Abbreviation)

第1章 文献综述

1．1 STC-1研究进展

1．1．1 斯钙素概述

1．1．2 斯钙素的结构与分布

1．1．3 斯钙素1的作用

1．2 镉毒性的研究进展

1．2．1 镉对组织器官细胞的作用

1．2．2 解偶联蛋白家族与ROS的相关研究

1．2．3 Caspase家族研究进展

1．2．4 Bcl-2家族研究进展

第2章 研究目的与意义

第3章 材料和方法

3．1 试验材料

3．1．1 细胞株

3．1．2 实验试剂

3．1．3 实验仪器和设备

3．1．4 溶液配制

3．2 试验方法

3．2．1 细胞的培养

3．2．2 细胞的冻存与复苏

3．2．3 Annexin-V FITC／PI双染法检测细胞凋亡

3．2．4 细胞活性氧检测

3．2．5 实时荧光定量PCR检测

3．2．6 Westem-blot检测

第4章 结果与分析

4．1 MDBK牛肾细胞培养与镉处理的形态学变化

4．2 镉处理细胞STC-1 mRNA与蛋白表达变化

4．2．1 镉处理细胞STC-1 mRNA表达量变化

4．2．2 氯化镉对STC-1蛋白表达的影响

4．3 hSTC-1重组蛋白对镉诱导细胞凋亡的影响

4．3．1 hSTC-1重组蛋白对镉诱导细胞Caspase-3基因表达的影响

4．3．2 hSTC-1重组蛋白对镉诱导细胞Bcl-2基因表达的影响

4．3．3 hSTC-1重组蛋白对镉诱导细胞UCP-2基因表达的影响

4．3．4 Annexin-V FITC／PI双染法检测hSTC-1重组蛋白对镉诱导细胞凋亡情况的影响

4．3．5 流式细胞仪检测hSTC-1重组蛋白对镉诱导细胞ROS产生量的影响

第5章 讨论与结论

5．1 镉对STC-1的上调作用

5．2 STC-1对镉诱导细胞凋亡的抑制作用

5．2．1 凋亡基因Caspase-3表达量变化

5．2．2 凋亡基因Bcl-2表达量变化

5．2．3 凋亡基因UCP-2表达量变化

5．2．4 流式细胞仪检测细胞凋亡与ROS产生量

5．3 结论

参考文献

致谢