芽胞@胶体金微球用于检测猪胸膜肺炎放线杆菌感染血清中ApxIVA抗体

摘要

猪传染性胸膜肺炎(PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起的一种严重猪呼吸系统接触性传染病，给世界范围内的养猪业造成了巨大的经济损失。因此，该病的有效检测对疫情的防控和发现有重要的意义。ApxIV毒素是可以被APP的15种血清型菌株在体内分泌的毒素蛋白，所以基于ApxIVA抗体的检测已成为诊断猪是否感染APP的重要方法。悬浮芯片技术(SAT)是20世纪末发展起来的一种多元化分析技术，综合运用了激光技术、流式细胞技术和生物信息技术，因其检测快速、操作简单、准确性好及高通量等特点，已成为一种具有影响力的对蛋白质、核酸等生物分子进行大规模分析的平台。
　　本实验以解淀粉芽胞杆菌的芽胞作为固相微球载体，用超声方法和化学试剂对芽胞进行处理之后，使其表面光滑、性质均一。然后将胶体金纳米颗粒吸附在芽胞表面，制备芽胞@胶体金功能微球。通过对微球进行TEM、XRD、XPS、FTIR等电镜和光谱学技术表征后，发现胶体金纳米颗粒的吸附与芽胞表面蛋白的巯基、羧基和氨基基团的相互作用有关。将制备的功能微球用于检测感染APP血清中ApxIVA抗体，复合微球首先固定ApxIVA抗原，然后孵育待检测血清，再依次与生物素-IgG和Cy5-链霉亲和素反应。利用抗原与抗体及生物素与链霉亲和素的特异性结合，将荧光素Cy5标记在微球的表面，完成对悬浮微球的荧光编码。通过相关条件的优化后，用本方法制备的功能微球在检测中具有良好的线性、重复性和灵敏度。在160-10240倍稀释的标准阳性血清中R2=0.9956，11组重复实验中相对标准偏差为4.1％，检测限为20480倍稀释的标准阳性血清，远远低于传统的ELISA方法(S/N=3)。此外，用本方法与商用ApxIVA—ELISA试剂盒共同分析了54份临床猪血清，比较其结果发现，本方法的敏感度为92.6%，符合率为88.9%，特异性为85.2%。由此表明，本实验构建的芽胞@胶体金微球，有作为悬浮芯片用于免疫分析检测中的巨大潜力和应用前景。

目录

声明

缩略词表（Abbreviation）

1文献综述

1.1胸膜肺炎放线杆菌

1.1.1胸膜肺炎放线杆菌简介

1.1.2 RTX毒素

1.1.3 Apx毒素

1.2悬浮芯片技术

1.2.1悬浮芯片技术简介

1.2.2悬浮微球的特点

1.2.3复合式悬浮芯片

1.3 芽胞在生物分析和生物医药的应用

1.3.1 芽胞作为全细胞生物传感器

1.3.2 芽胞表面展示蛋白和多肽

1.3.3 芽胞在生物医学的应用

1.4 流式细胞术

1.4.1流式细胞术的发展

1.4.2流式细胞仪的组成

1.4.3流式细胞术的应用

1.5 课题背景及研究内容

2 芽胞@胶体金微球的制备

2.1 实验材料

2.1.1 主要仪器

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要溶液配置

2.2 实验方法

2.2.1解淀粉芽胞杆菌芽胞的培养

2.2.2解淀粉芽胞杆菌芽胞的预处理

2.2.3胶体金的制备

2.2.4芽胞@胶体金微球的制备

2.2.5芽胞@胶体金微球的XRD表征

2.2.6芽胞@胶体金微球的XPS表征

2.2.7芽胞@胶体金微球的FTIR表征

2.3 结果与分析

2.3.1解淀粉芽胞杆菌芽胞的预处理

2.3.2 解淀粉芽胞杆菌芽胞的计数

2.3.3 胶体金的制备

2.3.4芽胞@胶体金微球的制备

2.3.5芽胞@胶体金微球的XRD表征

2.3.6芽胞@胶体金微球的XPS表征

2.3.7芽胞@胶体金微球的FTIR表征

3 芽胞@胶体金微球用于血清中ApxIVA抗体的检测

3.1 实验材料

3.1.1 主要仪器

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要溶液配置

3.2实验方法

3.2.1实验原理

3.2.2 Bradford法测定ApxIVA蛋白浓度

3.2.3流式细胞术荧光素的选择

3.2.4芽胞@胶体金微球固定ApxIVA抗原蛋白最佳用量选择

3.2.5芽胞@胶体金微球固定ApxIVA抗原蛋白最佳时间选择

3.2.6免疫反应过程

3.2.7 ELISA操作步骤

3.2.8线性、灵敏性和重复性试验

3.2.9 特异性试验

3.2.10 流式细胞术和ELISA试剂盒两种检测方法的比较

3.3 结果与分析

3.3.1 Bradford法测定ApxIVA蛋白浓度

3.3.2流式细胞术荧光素的选择

3.3.3芽胞@胶体金微球固定ApxIVA抗原蛋白最佳用量选择

3.3.4芽胞@胶体金微球固定ApxIVA抗原蛋白最佳时间选择

3.3.5 免疫条件的优化

3.3.6线性、灵敏性和重复性试验

3.3.7特异性试验

3.3.8 临床猪血清的比较分析

4 讨论与小结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文