缺氧调节奶牛子宫内膜上皮细胞表达MUC1和S100A11的研究

摘要

研究表明，在胚胎附植过程中，胎盘完全建立之前，子宫局部呈现缺氧状态，缺氧造成的子宫内环境的变化可影响多种基因的表达，从而影响着床。本实验室前期研究已证明缺氧可影响奶牛胚胎关键识别基因BOLA-A的表达。
　　粘蛋白1(MUC1)存在于卵巢、乳腺、胰腺、子宫等多种上皮组织及器官中，是一种跨膜蛋白，分子量高，糖基化水平高。在细胞信号转导中起重要作用，并且能够调节细胞黏附，润滑上皮组织，在上皮组织的保护中起到一定作用。研究显示，在人的生殖周期中，子宫内膜上皮中的MUC1表达呈一定规律性，并在分泌中期（着床窗口期）表达量最高。着床窗口期的MUC1表达量与着床率存在一定关系，可作为子宫容受性标志之一。
　　S100A11是钙结合蛋白S100家族中的成员，在肾、肺、皮肤和胎盘等多种组织中均有表达，调节以钙离子为信使的细胞信号转导，与细胞周期及凋亡、炎症疾病、癌症等均有相关。在人类的研究显示，S100A11存在于子宫的腺上皮和腔上皮，分泌中期表达量高，并且这一时期的低表达与低着床率及不明原因流产存在一定的联系。
　　在人类研究中，以上两个基因对妊娠起关键作用的时期均为着床窗期，而这一时期母胎界面处于相对缺氧状态。MUC1与S100A11在奶牛子宫上皮细胞中的表达与否以及缺氧是否对奶牛子宫上皮细胞中二者的表达造成影响是本实验拟解决的科学问题。
　　本实验以体外培养4代的奶牛子宫内膜上皮细胞为实验材料，利用本实验室前期建立起的CoCl2缺氧模型，通过RT-PCR与Western Blot技术，在mRNA和蛋白水平检测MUC1与S100A11的表达情况，从而进一步了解缺氧对妊娠调控起到的作用。
　　研究结果显示:奶牛子宫内膜上皮细胞表达MUC1和S100A11基因，用不同浓度（低剂量组:100 umol/L;中剂量组:200 umol/L;高剂量组:400 umol/L）CoCl2处理细胞造成缺氧后发现在3h后中、高剂量组MUC1基因水平明显上调，6h及12h后低、中、高剂量组mRNA水平均显著高于对照组，且高剂量组基因表达结果明显高于中、低剂量组。S100A11基因在不同浓度的二氯化钴刺激下，各时间点mRNA表达水平与对照组相比均显著上调，并且12h后高剂量组结果显著高于中、低剂量组。不同浓度的二氯化钴处理奶牛子宫内膜上皮细胞3h和6h后，各组MUC1和S100A11蛋白水平与对照组无显著差异。12h后，检测各组蛋白水平的变化，结果表明高剂量组MUC1表达水平显著高于其他组，其余各组间无明显差异。S100A11在12h后各组蛋白表达水平均无统计学差异。
　　结果表明，缺氧均在mRNA水平显著提高奶牛子宫内膜上皮细胞表达MUC1和S100A11，且呈现显著的剂效和时效关系，且MUC1高剂量12h高剂量组蛋白表达显著上调。推测MUC1可能参与了奶牛胚胎着床期子宫内环境的构建。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 妊娠早期缺氧环境成因

1．2 缺氧模型建立

1．2．1 缺氧模型的选择

1．2．2 二氯化钴制造体外缺氧模型的基本原理

1．2．3 奶牛子宫内膜上皮细胞的二氯化钴缺氧模型

1．3 粘蛋白1(MUC1)研究进展

1．3．1 MUC1结构和基本功能

1．3．2 子宫内膜中MUC1研究进展

1．4 S100A11研究进展

1．4．1 S100A11结构及基本功能

1．4．2 S100A11在生殖方面的研究进展

1．5 研究目的与意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要试剂配制

2．2 试验方法

2．2．1 奶牛子宫内膜上皮细胞样品的采集及预处理

2．2．2 奶牛子宫内膜上皮细胞体外原代培养

2．2．3 奶牛子宫内膜上皮细胞传代培养及鉴定

2．2．4 细胞冻存

2．2．5 细胞计数

2．2．6 CoCl2缺氧处理奶牛子宫内膜上皮细胞

2．2．7 实时荧光定量PCR

2．2．8 Western Blot检测

2．2．9 统计学分析

3 结果与分析

3．1 MUC1和S100A11基因在奶牛子宫内膜上皮细胞表达的检测

3．2 二氯化钴对奶牛子宫内膜上皮细胞MUC1和S100A11基因在mRNA水平表达的影晌

3．3 二氯化钴对奶牛子宫内膜上皮细胞MUC1和S100A11基因在蛋白水平表达的影响

4 讨论

4．1 MUC1与S100A11在奶牛子宫内膜上皮细胞中表达

4．2 缺氧对MUC1的影响

4．3 缺氧对S100A11的影响

4．4 小结

5 结论

参考文献

致谢