猪细小病毒的VP2蛋白在杆状病毒中的表达及免疫原性的研究

摘要

猪细小病毒（PPV），作为细小病毒属成员，是引起猪繁殖障碍的主要病原之一，能导致母猪死胎、流产、木乃伊胎等。该病在世界范围内广泛流行，对各国养猪业造成了巨大的经济损失。PPV的血清型较为单一，并具有较强的免疫原性，疫苗免疫是预防猪细小病毒病最有效的方法。目前，临床上大多使用灭活疫苗，但生产过程中容易出现病毒扩散的潜在风险。亚单位疫苗制备简单，生产过程相对安全，是新型疫苗研发的重要方向。本研究，制备了表达的猪细小病毒VP2蛋白的重组杆状病毒，并在豚鼠体内对其免疫效果进行了评价。
　　本研究主要内容包括：⑴用PCR方法扩增得到PPV的VP2基因，将其克隆至供体载体pFastBacI中，构建成为重组质粒pFastBacI-VP2。然后将该重组质粒转化至DH10Bac感受态细菌中，从而获得Bacmid-VP2的穿梭载体。用此穿梭载体转染sf9昆虫细胞，拯救重组杆状病毒AcMNPV-VP2。随后用SDS-PAGE、Western Blot和间接免疫荧光实验等方法均证明AcMNPV-VP2在sf9昆虫细胞中成功表达了VP2蛋白。电镜观察AcMNPV-VP2感染的细胞切片，发现VP2蛋白可自行装配成病毒样颗粒（VLPs），进一步证明了VP2已经表达成功。⑵收集重组杆状病毒感染的细胞，将裂解后的蛋白作为抗原免疫豚鼠，共免疫2次，每次免疫间隔2周。在第一次免疫后的第3周、5周、7周、9周、11周，采集豚鼠血清，并采用血凝集抑制（HI）试验检测豚鼠体内PPV的抗体水平。结果表明，杆状病毒免疫豚鼠后，可以有效激发HI抗体，最高可达1：210，并且抗体能持续存在8周以上。研究表明，重组杆状病毒AcMNPV-VP2表达的VP2蛋白不仅能形成病毒样颗粒，而且具有很好的免疫原性，从而为将来研制猪细小病毒亚单位疫苗和诊断抗原奠定了基础。

目录

声明

缩略语表(Abbreviation)

1.前言

1.1猪细小病毒的病原学

1.2猪细小病毒病的流行病学

1.3猪细小病毒病的诊断

1.4 猪细小病毒病的临床症状

1.5猪细小病毒的血凝性

1.6 猪细小病毒的分子结构

1.7 猪细小病毒主要蛋白的介绍

2.1材料

2.2实验方法

3.结果和分析

3.1 PRC扩增产物的鉴定结果

3.2 VP2与pFastBacI双酶切后回收的结果

3.3 重组质粒的双酶切鉴定

3.4 重组质粒的PCR鉴定

3.5 细胞病变的显微镜观察

3.6 间接免疫荧光实验结果

3.7 表达蛋白进行Western blotting的验证结果

3.8病毒粒子的电镜图片

3.9病毒扩大培养后PCR鉴定

3.10血凝抑制抗体效价的测定结果

4.讨论

4.1猪细小病毒及疫苗

4.2杆状病毒

4.3 重组杆状病毒表达系统的构建方法

4.4重组杆状病毒表达系统的特点

4.5 VP2蛋白

4.6 电镜切片

4.7 动物实验

4.8 HA和HI

5结论

参考文献

致谢