inaC基因在橘小实蝇光响应中的功能研究

摘要

橘小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel)寄主范围广，喜产卵于果实内，幼虫潜食为害，对果蔬种植业造成严重损失。色板诱捕和灯光诱杀是在橘小实蝇成虫视觉光响应行为的研究基础上产生的安全无害、操作简便的防治手段。eye-PKC蛋白是眼特异性表达的蛋白激酶C，参与信号转导、光的适应等过程，激活视紫红质转化为变视紫质，但能否影响橘小实蝇光响应的生物学行为，目前昆虫中还未报道过。
　　本研究以eye-PKC蛋白的编码基因inaC为靶标基因，利用RNAi技术和实时荧光定量PCR等分子生物学技术检测橘小实蝇各虫龄虫态和不同组织的表达模式，并通过观察橘小实蝇趋光行为和交配行为，研究inaC基因在橘小实蝇光响应中的作用。研究结果为橘小实蝇的视觉反应奠定理论基础，同时也为防治橘小实蝇提供参考价值。
　　1.橘小实蝇inaC基因的克隆和基因表达模式分析
　　成功克隆了橘小实蝇inaC基因cDNA全长，ORF长为2052bp，编码683个氨基酸。SMART软件预测基因的结构域，结果显示橘小实蝇inaC基因编码蛋白与果蝇INAC蛋白结构相似，包含2个PKC保守域C1、1个PKC保守域C2、1个STKc结构域和1个S_TK_X结构域。基因同源性分析结果显示inaC氨基酸序列与近缘昆虫相似性度很高，与瓜实蝇Bactrocera cucurbitae、地中海实蝇Ceratitis capitata相似度达到97％，黑腹果蝇Drosophila melanogaster相似度达到84％，家蝇Muscadomestica相似度达到83％，与丽蝇Calliphora vicina相似度达到82％。橘小实蝇inaC氨基酸序列与其相似度较高的这几种昆虫eye-PKC氨基酸构建系统发育树，进化距离由近及远依次为地中海实蝇、瓜实蝇、黑腹果蝇、丽蝇、家蝇，与同源性比对结果一致。
　　通过实时荧光定量PCR技术检测橘小实蝇inaC基因在不同时期和不同组织的表达模式。不同虫龄橘小实蝇中，inaC在卵期和幼虫期几乎不表达，蛹期表达量较低，成虫期高表达，发育成熟的成虫表达量接近刚羽化成虫的1.75倍。橘小实蝇成虫不同组织中，inaC基因在头部高表达，而在其他组织几乎不表达。
　　2.inaC在橘小实蝇趋光行为中的作用
　　诱导大肠杆菌HT115表达inaC dsRNA，用饲喂dsRNA的方法进行生测实验。实时荧光定量PCR检测橘小实蝇成虫头部inaC表达量，结果表明inaC dsRNA可以在橘小实蝇中产生系统性干扰效应，与对照组相比，喂食inaC dsRNA头部inaC基因表达量下调54％。
　　利用Y型管检测橘小实蝇成虫在两个光源之间进行选择的趋性差异。橘小实蝇对紫光和黄光趋向性强于红光、橙光、绿光、蓝光，而紫光与黄光两种光源比较时选择无颜色偏好。干扰inaC基因后，紫光与红光、橙光、绿光进行两两比较时，橘小实蝇的紫光选择率降低（与egfp dsRNA处理组相比，对紫光的选择率分别由75％、80.77％、81.16％降低为55％、54.43％、59.74％）;黄光与红光、橙光、蓝光两两比较时，橘小实蝇的黄光选择率降低（与egfp dsRNA处理组相比，对黄光的选择率分别由75.32％、71.05％、71.25％降低为59.42％、51.35％、47.14％）。黄光和紫光比较时由趋性无颜色偏好（egfp dsRNA组黄光选择率为48.75％，紫光选择率为51.25％），变为更趋向黄光运动（干扰组橘小实蝇黄光选择率为80.88％）。结果表明干扰inaC基因，橘小实蝇在两个光源之间选择的过程中对紫色和黄色的趋性减弱，且对紫光的影响更显著。
　　3.inaC在橘小实蝇交配行为中的作用
　　橘小实蝇在完全黑暗条件下不交配，在白光下1小时内成功交配率较低（交配率为40％），红光、橙光、黄光、绿光、蓝光、紫光的交配率较高，都能达到80％以上。黄光、绿光下橘小实蝇从雌雄混合开始到交配成功的求偶时间较红光、橙光、蓝光、紫光更长，红光、橙光、蓝光、紫光在20分钟成功交配比率为80％左右，黄光、绿光只有50％左右。干扰inaC后，绿光和紫光条件下橘小实蝇1小时内成功交配率显著下降（绿光，egfp dsRNA组成功交配率为95％，inaC dsRNA组成功交配率为50％，x2=10.16，d.f.=1，p＜0.01;紫光，egfp dsRNA组成功交配率为100％，inaCdsRNA组成功交配率为60％，x2=10.00，d.f.=1，p＜0.01），其它颜色光照两组没有显著性差异;橙光、黄光、绿光、紫光条件下，橘小实蝇整体求偶时间延长，30min前干扰组成功交配的试虫对数较少（30min时干扰组与对照组差异:橙光x2=5.01，;黄光x2=6.47，p＜0.05;绿光x2=8.29，p＜0.01;紫光x2=7.03，p＜0.01）。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1 橘小实蝇的研究现状

1．1 橘小实蝇的分布和为害概况

1．2 橘小实蝇的生物学特性

1．3 橘小实蝇的物理防治

2 昆虫视觉相关研究现状

2．1 昆虫的眼

2．2 昆虫趋光行为

2．3 昆虫广义的光响应

3 inaC基因的功能和研究

3．1 inaC蛋白概述

3．2 昆虫眼特异性蛋白激酶C功能研究

4 本研究的目的意义和创新点

4．1 本研究的目的意义

4．2 本研究的创新点

5 技术路线

第二章 橘小实蝇inaC基因的克隆和表达模式研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 总RNA的提取

2．2 inaC基因片段克隆

2．3 inaC基因全长克隆

2．4 橘小实蝇inaC基因序列分析

2．5 橘小实蝇inaC基因的表达模式

3 讨论

第三章 inaC基因在橘小实蝇光响应中的功能研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 实验方法

2 结果与分析

2．1 inaC dsRNA片段的扩增

2．2 表达载体的筛选与鉴定

2．3 dsRNA的表达

2．4 实时荧光定量PCR检测干扰效果

2．5 inaC对橘小实蝇光响应的影响

3 讨论

第四章 结论与展望

参考文献

攻读学位期间发表的论文

致谢