MicroRNA-136对RIG-I信号通路双重调控及在A549细胞上抑制H5N1流感病毒复制机制的研究

摘要

H5N1亚型流感病毒在禽和包括人类在内的哺乳动物中引起严重的呼吸道疾病，并诱发很高的死亡率。根据世界卫生组织的研究调查报告，H5N1流感病毒在人群中可导致高达60％的死亡率。因此，为了控制病毒传播和扩散，研究有效预防或者治疗流感病毒感染的药物已是当务之急。microRNA作为一种多功能调节因子，正日益被广泛地研究并用作抑制病毒感染的潜在治疗药物。然而，关于阐释microRNA在调控病毒与宿主相互作用关系的机制研究仍然十分匮乏。我们之前的microRNA芯片结果显示，A/duck/Hubei/hangmei01/2006（简称H5N1/HM）病毒感染A549细胞后，有一小部分microRNA表达发生异常，其中miR-136诱导上调表达最为明显，上调达到5倍。随后我们选取其中三个差异表达的microRNA分别检测它们是否影响 H5N1/HM病毒增殖。结果发现， miR-136在 A549细胞上具有很强的抑制H5N1/HM病毒复制效果，同时也对A/chicken/Hubei/327/2004（简称H5N1/DW）病毒以及VSV病毒的复制都有很好的抑制效果。接下来，我们对miR-136发挥抗病毒活性的分子机制进行了详细研究。
　　主要研究内容如下：
　　1 miR-136靶基因的预测、筛选和验证：
　　我们用microRNA靶标在线预测软件miRanda、TargetScan、PITA和RNA22等在基因组范围内对miR-136的靶位点进行了预测，经过分析并筛选了43个候选靶基因，这些候选靶基因同时被两个软件预测到有靶点或者功能上与病毒复制周期密切相关。随后，我们克隆这些基因的3’UTR序列并连接至双荧光素酶报告载体pmirGLO质粒上。经过实验筛选，我们最终确定并实验验证IL-6是miR-136的一个调控靶基因。靶点突变和删除实验证实了miR-136在IL-6 mRNA上的有效靶点位置，并且我们用生物素化的miR-136成功富集了IL-6的mRNA。而且，在poly（I:C）刺激或者病毒感染的状态下，miR-136能够很明显的负调控IL-6的表达。该实验结果表明，miR-136是IL-6真实的负调控因子。但是令人意外的是，当我们研究miR-136对内源性IL-6表达的影响时，发现IL-6 mRNA、胞内IL-6蛋白、分泌型IL-6蛋白表达量都急剧上升。这提示miR-136参与了其它免疫通路的调控，而不仅限于对IL-6靶点的调控。
　　2 miR-136是RIG-I受体分子的配体
　　据报道，dsRNA可以作为TLRs、RIG-I、PKR等免疫分子的配体而诱发强烈的天然免疫反应，并最终表现为其下游效应分子的大量表达，如TNF-α、IL-6、IFN-β、OASL等。而dsRNA的这种免疫激活能力可以被其内部碱基化学修饰而消除。我们的研究发现，2’-O-methyl修饰的miR-136免疫激活能力消失，而且在免疫不敏感细胞293T细胞上也几乎不能诱导IL-6和IFN-β的表达。根据这个特性，我们断定miR-136很有可能具有激活某种模式识别受体分子的能力。
　　随后我们对TLRs、RIG-I、PKR受体分子进行了筛选，结果发现沉默RIG-I分子后，miR-136的免疫激活能力显著下降。另外，miR-136与RIG-I分子在诱导天然免疫过程中具有明显的协同加强效应。miR-136能够诱导包括RIG-I在内的多数免疫基因的表达，这一性质与已知RIG-I配体分子miR-145非常类似。实验结果证实，这两个microRNA都能诱导RIG-I蛋白的上调表达，同时化学修饰的miR-136能够明显竞争抑制miR-145诱导的天然免疫反应。因此，所有这些证据加强了这样一个假设：即RIG-I最有可能是miR-136的免疫受体分子。然而，为了进一步证明该假设，我们用间接荧光免疫实验证实了miR-136与RIG-I在细胞质中存在共定位。而且用RNA免疫沉淀技术以及miR-136 pulldown技术共同证明了miR-136与RIG-I之间存在直接的物理相互作用关系。
　　另外，为了知道内源miR-136是否足够参与调控RIG-I通路，我们用miR-136特异性抑制物（inhibitor）抑制细胞内源miR-136表达，并检测RIG-I、IL-6、IFN-β表达水平，结果证明这些免疫分子表达受到明显负调控。进一步实验结果显示，由miR-136引起的免疫水平削弱一定程度促进了流感病毒和VSV病毒的增殖。
　　3 miR-136小鼠保护实验
　　当我们将miR-136通过尾静脉注射进入小鼠体内后再攻毒，发现注射miR-136能使小鼠体重下降更缓慢，延长小鼠存活时间2-3天，并显著减少小鼠肺脏病毒载量。我们对肺脏IL-6、IFN-β和RIG-I分子检测发现，miR-136可诱导较高水平的IFN-β和RIG-I水平，而同时抑制IL-6水平的急剧增高，这一结果与小鼠体重变化和死亡情况非常相符。虽然miR-136实验组小鼠全部死亡，但是miR-136抑制病毒增殖的效果不能忽略。
　　4 miR-136激活RIG-I受体的结构特点
　　我们对miR-136激活RIG-I分子的分子机制作了初步的探索。实验结果显示， miR-136分子中的poly(UUUU)序列以及5’端碱基序列对miR-136的免疫激活能力必不可少，这两个位点的序列突变都将导致其免疫激活能力丧失。而3’端序列的变化对其免疫激活能力影响不大。另一方面，miR-136双链序列的长度对其功能也具有决定作用。5’或3’碱基的截短都会导致其免疫激活作用严重削弱甚至消失。因此， miR-136序列特异性和必要的长度是决定其具备免疫激活能力的关键因素。然而，究其激活RIG-I受体分子的具体分子机制还有待更深入的研究。总的来说，本研究确定了miR-136在RIG-I信号通路中扮演双重调节因子的角色：RIG-I受体的配体和IL-6负调控因子，也因此，miR-136具有很好的病毒抑制效果。本研究的主要意义在于：提示以microRNA作为配体的模式识别受体分子信号通路激活途径在抗病毒过程中发挥着重大作用。

目录

声明

缩略语表

第一部分 文献综述

1.1流感病毒

1.2 microRNA概述

本研的目的意义

第二部分 实验材料与方法

2.1材料

2.2方法

第三部分：结果与分析

3.1 microRNA对流感病毒影响

3.2 H5N1/HM病毒对细胞miR-136表达的影响

3.3过量表达miR-136抑制流感病毒增殖

3.4 miR-136对VSV病毒增殖的影响

3.5 miR-136靶点的预测以及筛选

3.6 miR136与IL-6 mRNA相互作用的验证

3.7 miR-136增强IL-6的表达

3.8 miR-136对IL-6和IFN-β表达的影响

3.9 miR-136对免疫基因表达的影响

3.10 2’M-miR136对免疫的抑制效应

3.11 2’M-miR136抑制IL-6的表达

3.12 2’M-miR136免疫抑制及miR-136对293T细胞免疫不敏感

3.13沉默RIG-I抑制miR136免疫激活能力

3.14氯喹对miR-136诱导天然免疫的影响

3.15 RIG-I与miR-136免疫激活的协同效应

3.16 miR-136促进RIG-I的蛋白表达

3.17 miR-136对miR-145诱导天然免疫的抑制

3.18 miR-136与RIG-I分子相互作用的验证

3.19内源性miR-136对RIG-I信号通路的影响

3.20 miR-136对小鼠的保护性试验

3.21小鼠肺脏病毒滴度与免疫基因表达检测

3.22 miR-136，IL-6及流感病毒三者之间的联系

3.23 miR-136 激活RIG-I信号通路分子结构特点的探索

第四部分 讨论

4.1流感病毒与miR-136之间的关系

4.2 miR-136与IL-6和天然免疫之间的关系

4.3 miR-136是RIG-I分子的配体

4.4 miR-136激活RIG-I信号通路的分子结构特点

4.5 miR-136作为药物靶标的潜能

4.6 miR-136的生理功能

4.7小结

第五部分 总结

参考文献

致谢

附录