FHL3与MyoD和pCREB蛋白相互作用差异调控MyHC各亚型基因表达的分子机制

摘要

不同肌肉纤维类型肌球蛋白重链(Myosin Heavy Chain，MyHC)亚型基因是目前公认的区分不同肌纤维类型的分子标记，因此发现调控MyHC亚型基因的表达调控机制，对提高肉质性状和肉品质具有重要的意义。FHL3蛋白属于LIM蛋白超家族成员之一，不能结合DNA启动子序列，只能通过结合其它转录因子调控下游基因表达。迄今为止关于FHL3是否调控MyHC各亚型基因表达还未见报道。本研究以小鼠C2C12成肌细胞为模型，展开了FHL3对四种MyHC亚型基因的影响及其调控的分子机制的研究，取得了如下主要研究结果:
　　1.利用构建的FHL3超表达载体pcDNA3.1-FHL3和针对FHL3基因的干涉(siFHL3)片段转染C2C12成肌细胞，采用实时定量PCR、Western blotting、和免疫荧光技术检测了超表达和干涉FHL3基因前后MyHC各亚型基因表达变化;发现了FHL3对MyHC2a和MyHC2b有正调节作用，对MyHC1/slow有负调节作用，而对MyHC2x无影响。
　　2.开展了共转染试验，首先利用pcDNA3.1-FHL3和MyoD干涉片段共转C2C12细胞，发现干涉MyoD同时超表达FHL3后MyHC2a，MyHC2b蛋白水平仍有显著增加，而MyHC1/slow表达水平却没有显著变化。之后利用pcDNA3.1-MyoD和FHL3干涉片段共转染C2C12成肌细胞进一步验证，发现干涉FHL3后，增强了MyoD超表达对MyHC1/slow基因表达的促进作用。以上结果表明FHL3主要通过抑制MyoD转录活性下调MyHC1/slow基因表达，而对MyHC2a，MyHC2b基因的表达调控可能存在其它机制。
　　3.开展了MyHC2a启动子区域缺失片段与pcDNA3.1-FHL3共转染C2C12成肌细胞试验，发现FHL3超表达显著提高了含有环化的AMP反应元件(cyclicAMP-responsive elements，CRE)的启动子活性，在此基础上，通过CREB超表达和干涉试验验证了CREB能够促进MyHC2a基因表达。
　　4.开展了pcDNA3.1-FHL3和CREB干涉片段(siCREB)共转染细胞试验，验证了FHL3是通过CREB蛋白调控MyHC2a基因表达，并且磷酸化CREB(pCREB)在调控MyHC2a基因表达中发挥着主要作用;利用免疫沉淀技术验证了FHL3可以与CREB、pCREB、MyoD及其共转录激活因子p300相互结合，当MyoD和pCREB两种蛋白共同存在的情况下，FHL3与pCREB的结合能力更强。
　　5.利用EMSA和ChIP技术检测了CREB与MyHC2a基因启动子CRE元件的结合能力。结果表明非磷酸化的CREB与pCREB都能结合MyHC2a启动子上的CRE结合元件，但以pCREB结合为主，并且FHL3基因干涉后显著降低了pCREB与MyHC2a启动子的结合能力。
　　综上所述，FHL3对MyHC2a和MyHC2b基因的表达具有正调节作用，对MyHC1/slow基因表达有负调节作用;FHL3通过抑制MyoD转录活性下调MyHC1/slow基因表达，同时通过与pCREB和p300蛋白互作上调MyHC2a基因表达。本研究结果将为不同肌肉纤维类型形成的分子调控研究开拓新的思路和途径，同时也为动物肉用性状的遗传改良提供重要的理论依据。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

第一章 文献综述

1 骨骼肌肌纤维类型分类及其与肉质性状的关系

1．1 骨骼肌肌纤维类型分类

1．2 不同肌纤维类型的特征

1．3 骨骼肌肌纤维类型与肉质性状的关系

2 不同肌纤维类型形成的分子调控机制研究进展

2．1 肌源调节因子(MRFs)途径

2．2 胰岛素样生长因子(IGFs)信号通路

2．3 过氧化物酶体增生物激活受体辅激活蛋白1(peroxisomeproliferator-activated receptor-gamma coactivator，PGC-1α)信号通路

2．4 钙调磷酸酶-活性T细胞核因子(CaN-NFAT)信号通路

2．5 Sox6信号通路

2．6 TEAD-1信号通路

2．7 MicroRNAs对不同肌纤维类型形成的调控机制

3 FHL3家族的研究进展

3．1 LIM蛋白分类性质及生物学功能

3．2 FHL家族成员及特点

3．3 FHL3的功能及其调控机制

4 本研究的目的和意义

第二章 材料和方法

1 实验材料

1．1 实验样品

1．2 主要仪器和设备

1．3 主要试剂与试剂盒

1．4 常用试剂及配制

1．5 应用的生物信息学网站及分析软件

1．6 所用载体

2 试验方法

2．1 细胞培养

2．2 FHL3超表达载体构建

2．3 FHL3-siRNA干涉片段的选取

2．4 脂质体介导的细胞转染(6孔板)

2．5 Quantitative real-time PCR分析

2．6 Western blotting分析

2．7 免疫荧光

2．8 C2C12细胞DNA提取

2．9 MyHC 2a基因5’端上游调控区域缺失载体

2．10 细胞的转染(24孔板)

2．11 双荧光素酶活性的检测

2．12 转录因子结合位点突变载体构建

2．13 质粒共转染

2．14 核蛋白提取

2．15 EMSA

2．16 ChIP

2．17 CREB超表达载体的构建

第三章 研究结果与分析

1 超表达FHL3对MyHC各亚型基因表达的影响

1．1 FHL3超表达载体的鉴定

1．2 超表达FHL3后MyHC各亚型基因表达量的变化

2 干涉FHL3对MyHC各亚型基因表达量的影响

3 FHL3基因调控MyHC 1／slow基因表达的分子机制

4 FHL3基因调控MyHC 2a基因表达分子机制

4．1 共表达FHL3和MyoD基因对MyHC 2a基因表达的影响

4．2 MyHC 2a基因5'端上游调控区域缺失载体的构建

4．3 MyHC 2a基因5'端上游调控区域缺失片段的转录活性分析

4．4 CREB基因对MyHC 2a基因表达的影响

4．5 FHL3基因通过CREB调控MyHC 2a基因表达

4．6 FHL3通过CREB磷酸化水平调控MyHC 2a基因表达

4．7 FHL3蛋白与CREB蛋白相互作用验证

4．8 体外和体内实验验证CREB和MyHC 2a启动子序列的结合

4．9 FHL3对CREB与MyHC 2a启动子片段结合能力的影响

第四章 讨论

1 FHL3基因在C2C12成肌细胞分化过程中的表达模式及其对MyHC基因表达的影响

2 FHL3调控MyHC 1／slow基因表达的信号通路

3 FHL3调控MyHC 2a因表达的信号通路

3．1 FHL3基因通过CREB蛋白正向调控MyHC 2a基因表达

3．2 FHL3可以同时与MyoD和pCREB结合，但与pCREB结合能力更强

4 FHL3基因差异调控MyHC基因表达的分子机制模型

第五章 总结

1 主要研究结果

2 主要创新点

2 不足之处

3 下一步工作计划

参考文献

在读期间发表论文列表

致谢