水稻CCT家族基因功能验证，OsMADS3新等位基因突变机制的研究

摘要

1.植物开花是一个受外界环境和内在基因共同调控的复杂过程，许多基因家族共同参与，形成调控网络。CCT基因家族基因参与调控植物开花。目前，水稻中41个CCT基因成员只有6个基因被证实调控开花。为更高效鉴定更多的CCT家族开花基因，本研究结合候选基因关联分析与连锁分析鉴定功能基因，通过转基因进行功能验证，并对其中一个CCT基因进行功能研究。研究结果如下:
　　1.1候选基因关联分析与功能验证
　　通过整合公共数据库的水稻开花期QTL信息，共得到59个水稻开花期QTLs，与水稻41个CCT基因的物理位置比较，发现有25个CCT基因位于QTL区间内。利用529份世界水稻种质资源对CCT家族基因与水稻抽穗期性状进行关联分析，共有19个CCT基因与抽穗期相关。我们选择了18个CCT基因进行转化验证，结果表明，8个关联基因落在QTL区间，有5个基因通过转基因验证确定调控开花;4个关联基因不在QTL区间，但有2个通过转基因验证与开花相关;6个既没关联到也不在QTL区间的基因都不参与水稻开花调控。
　　1.2 CCT家族基因表达模式与核酸多样性
　　根据基因所含功能结构域将CCT基因分为CMF亚家族，COL亚家族和PRR亚家族。在日本晴5个不同发育时期的叶片和茎秆中对CCT的35个基因进行了表达模式分析，发现三个亚家族的基因大部分都在叶片中表达丰富，部分基因在茎秆中也有较高的表达。41个CCT基因在529份栽培稻和107份野生稻中中共有4002个SNPs，CCT家族基因的平均核酸多样性兀=2.7×10-3，多数CCT基因的核酸多样性在每1kb有1到8个SNPs。
　　1.3 OsCCT01基因功能研究
　　OsCCT01属于CMF亚家族，超量表达OsCCT01导致中花11在长日照下抽穗期延迟25天，短日照下延迟15天。抑制表达OsCC T01则没有出现抽穗期相关表型。通过检测光周期途径相关基因在超表达植株中的表达，发现OsCCT01是通过抑制Ehd1基因及其下游Hd3a和RFT1基因的表达而抑制开花。除了抽穗期的表型，OsCCT01同时出现株高变矮，分蘖减少，产量下降等发育相关表型，通过激素处理发现OsCCT01对BR响应显著，检测BR受体基因OsBRI1和BR信号传导途径上的相关基因在超量植株中的表达水平的变化，推测OsCCT01参与BR信号传导途径;检测了细胞周期基因在超表达植株中的表达量差异，结果表明3个G2/M期的基因在OsCCT01超表达阳性植株中明显下降。推测，OsCCT01可能处在细胞周期核心调控元件的下游调节细胞分裂。OsCCT01对植株发育的机制有待深入研究。
　　2.作物遗传改良的基础是自然变异，自然变异是由自发突变形成。在构建重组自交系过程中，RI127发生自然突变成隐性雄性核不育系RI127S。通过图位克隆的方法鉴定出OsMADS3就是控制雄性不育的基因，该基因已有文献报道其调控花器官发育和雄性不育。利用交错式热不对称PCR分离到1633 bp序列插到OsMADS3基因内部，导致它不能正常转录而丧失功能。1633 bp序列来自第5染色体上一个反转座子的片段。分析OsMADS3在530份自然群体和107份普通野生稻中的核酸多态性，共有7种单倍型，98％的品种是都是H2类型，表明OsMADS3是功能特别重要的持家基因，在自然进化过程中必须高度保守，这与它决定雄性育性是吻合的。RI127S来自籼稻特青和广亲和品种02428杂交后代，携带02428的S5基因型。RI127具有优良的农艺性状和广亲和性，因此RI127S是轮回育种中一个好的中间体，省去轮回选择中品种间杂交的繁重人工去雄工作。RI127S既可以与籼稻杂交又可以与粳稻杂交，为育种家在轮回育种中提供灵活的方案。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 水稻CCT家族基因功能验证

1．前言

1．1 研究问题的由来

1．2 文献综述

1．3 本研究的目的和意义

2 材料方法

2．1 材料

2．2 遗传转化方法

2．3 田间材料种植和对应性状考察

2．4 数据整理与作图

2．5 CCT家族基因核酸多样性分析和关联分析

2．6 转基因拷贝数检测

2．7 细胞形态学观察

2．8 OsCCT01基因的表达模式检测

2．9 激素处理

2．10 亚细胞定位

2．11 短日照试验

2．12 节律性表达分析

2．13 DNA抽提

2．14 RNA的提取，RT-PCR和RealtimePCR

3．结果和分析

3．1 比较CCT家族基因和抽穗期QTLs在基因组上的位置

3．2 水稻CCT家族基因成员的进化与表达

3．3 CCT家族基因的核酸多样性

3．4 CCT家族基因与抽穗期的关联分析

3．5 通过遗传转化进行CCT家族基因的功能验证

3．6 OsCCT01的转基因功能验证

3．7 OsCCT01的表达模式

3．8 细胞形态学上观察超量OsCCT01后植株发育差异

3．9 激素处理

3．10 亚细胞定位

3．11 OsCCT01的节律性及其在光周期途径上的位置

4 讨论

4．1 候选基因关联分析结合连锁分析提高功能基因鉴定的效率

4．2 关联分析出现误差的原因

4．3 CCT家族基因的自然选择

4．4 CCT家族更多具有开花效应的基因等待挖掘

4．5 OsCCT01基因影响植株发育

第二章 OsMADS3新等位基因突变机制的研究

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 文献综述

1．3 本研究的目的与意义

2 材料和方法

2．1 研究材料

2．2 研究方法

3 结果与分析

3．1 RI127家系表型鉴定

3．2 遗传分析与突变基因初定位

3．3 比较测序确定控制育性性状的候选基因

3．4 插入突变分析

3．5 OsMADS3在突变体中功能丧失

3．6 近等基因系的芯片数据分析

3．7 OsMADS3的核酸多样性分析

3．8 RI127的广亲和性

4 讨论

4．1 反转座子插入导致了保守基因OsMADS3丧失功能

4．2 雄性不育系RI127S在轮回选择育种中的潜在价值

4．3 总结

参考文献

附录

作者简介

在读期间发表的论文与申请专利

致谢