比较基因组、转录组和基因功能研究揭示核盘菌致病和发育的分子机理

摘要

核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）是一种寄主范围广泛、世界性分布的典型死体营养型植物病原真菌，能够在多种经济作物（例如油菜，向日葵，大豆和扁豆等）上引起菌核病，给农作物生产造成巨大的经济损失。
　　为了从基因组水平上研究核盘菌的发育特性，对核盘菌及已测序真菌的基因组进行了功能注释和功能基因组比较分析。发现核盘菌基因组中与转座元件相关的类似CENP-B的DDE超家族核酸内切酶和反转录酶要远远多于其它真菌，这种显著的差异暗示了转座事件在核盘菌基因组的进化中起到了重要作用。进一步详细分析了核盘菌中的转座元件的种类和它们与类似CENP-B的DDE超家族核酸内切酶基因和反转录酶基因在基因组中的相对位置关系，表明这些酶家族基因的周围确实存在典型的转座元件。绝大多数类似于CENP-B的DDE超家族核酸内切酶都与DNA转座元件相关，其中TcMar-Fot1类群最多;所有反转录酶都与反转录转座元件相关，其中LINE/Tad1，LTR/Gypsy和LTR/Copia三个类群占比最多。对核盘菌及其它真菌中转座元件的种类和数量的比较发现，DNA和RNA转座元件均在核盘菌基因组的进化过程中起着重要作用。系统发育分析揭示类似CENP-B的DDE超家族核酸内切酶和反转录酶基因家族的扩张可能是核盘菌中相应转座元件在进化过程中短时间内大量复制扩增的结果。转录分析表明尽管这两大类转座子中的大部分已经“失活”，但少部分仍然具有“活性”，插入其它功能基因下游是其保持活性的方式之一。
　　利用数字表达谱检测了核盘菌在6个关键发育阶段（包括菌丝营养生长阶段、侵染阶段、菌核形成阶段、菌核菌丝萌发阶段、菌核子囊柄萌发阶段和子囊柄形成阶段）的转录组。为了从整体上阐述核盘菌不同功能模块活性在各个发育阶段的动态变化，建立一种“功能谱”的分析方法来衡量各种功能模块（例如GO功能模块、Interpro功能模块和KEGG代谢途径）的相对活性。功能谱分析可以将基因表达水平和基因功能注释结合起来描绘相应功能模块的相对活性。通过比较“功能谱”，明确了各个功能模块在核盘菌不同发育阶段的相对活性的动态变化。此外，利用基因功能富集分析法发现了核盘菌在不同发育阶段相对菌丝营养生长阶段所富集到的多个功能模块。
　　功能谱分析结果显示一条不完整的碳固定相关通路在核盘菌侵染、菌核菌丝萌发和菌核子囊柄萌发过程中被显著地激活。光合作用过程中植物的碳固定途径是将太阳能转化为生物质、生物产品和生物燃料的过程。对这条通路进行深入研究发现大量的异养型真菌也拥有和植物碳固定途径相关的各种酶类，其中的许多酶在真菌中都是保守的。在异养型的核盘菌中存在17个植物碳固定途径相关酶类的同源蛋白，在Calvin-Benson-Basham(CBB)还原型磷酸戊糖途径中有10个，在C4-二羧酸循环中有7个。尤其是在CBB循环中，只有5-二磷酸羧化加氧酶(Rubisco)和磷酸核酮糖激酶(PRK)在核盘菌中找不到同源蛋白。RNAi沉默试验证明许多和这条途径相关的酶类都在核盘菌的侵染和菌核形成过程中发挥重要作用。遗传发育分析表明许多碳固定相关酶类在进化中都经历了基因复制、基因丢失或获得和基因功能多样化事件。这些发现在碳固定层面展示了自养型生物和异养型生物之间的联系，表明在进化过程中碳固定相关基因的功能在不同物种中是动态变化的。
　　在核盘菌发育过程中，碳水化合物活性酶类相关的功能模块也受到了显著地诱导。比较基因组分析显示死体营养型和半活体营养型病原真菌的植物细胞壁降解酶和真菌细胞壁降解酶的数量都要比大多数活体营养型病原真菌中的多。然而，对核盘菌、禾谷镰刀菌、青杨叶锈菌和禾谷类柄锈菌中的碳水化合物活性酶类的转录分析表明在死体营养型和活体营养型真菌的侵染过程中，许多编码植物细胞壁降解酶类的基因和真菌细胞壁降解酶类的基因都显著上调表达，表明植物病原真菌中存在一种植物细胞壁降解和真菌细胞壁重组或修饰相伴随的普遍机制，该机制可能与病原真菌的侵染密切相关。此外，本研究的结果表明植物病原真菌细胞壁的重组和修饰还与其自身的发育相关。
　　小分泌蛋白在活体半活体营养型真菌和其寄主植物的互作中发挥了重要作用，然而对它们在寄主非特异性死体营养型真菌中的作用还知之甚少。转录组分析显示许多分泌蛋白编码基因在核盘菌菌核形成和侵染过程中显著上调表达。选取两个在核盘菌侵染过程中显著上调表达的富含半胱氨酸的小分泌蛋白，即SsCVNH和SsSSVP1进行深入研究，发现它们在核盘菌的致病过程中发挥重要作用。对SsSSVP1的进一步研究表明，SsSSVP1从菌丝中被分泌出来后可被植物细胞内化并且可在细胞间自主转运，这种转运不依赖于核盘菌本身。SsSSVP1主要定位于寄主的细胞质并可诱导植物细胞坏死。酵母双杂交、免疫共沉淀和荧光双分子互补试验均证实SsSSVP1与植物中蛋白QCR8互作，QCR8是植物线粒体呼吸链上细胞色素b-c1复合体中的一个亚基。双定点突变结果表明两个半胱氨酸残基（C38和C44）同时突变使SsSSVP1不能形成同源二聚体，不能和QCR8互作并失去了诱导植物细胞坏死的能力，说明部分半胱氨酸残基在维持SsSSVP1的结构和功能过程中发挥了重要作用。荧光共定位试验和荧光双分子互补试验显示SsSSVP1可以在QCR8进入线粒体之前将其“劫持”到细胞质中从而扰乱了QCR8的亚细胞定位。在烟草中进行的病毒介导的基因沉默试验表明沉默QCR8导致植株发育异常且引起植物细胞的坏死反应，提示SsSSVP1诱导的植物细胞坏死与SsSSVP1-QCR8之间的互作导致QCR8亚细胞定位的改变相关，QCR8亚细胞定位的改变可能使其丧失了生物学功能。这些结果表明小分泌蛋白在寄主非特异性死体营养型真菌中也作为潜在的效应因子发挥着重要作用。本研究揭示了小分泌蛋白在寄主非特异性死体营养型真菌和其寄主植物互作过程中的新功能，阐明这种互作类型的致病机制具有重要意义。
　　本文从基因组、转录组和分泌蛋白组等多个水平研究了核盘菌致病和发育的分子机制。本研究的结果表明核盘菌任何一个发育阶段都是多个基因组成一个密切联系的网络协同起作用的，但是这个网络中每个基因所发挥的作用和所处的地位并不相同，存在某些关键的“节点基因”对某些生物学进程起着决定性作用。本文结合核盘菌的数字表达谱和生物信息学方法一方面全面分析了核盘菌发育过程中各种功能模块（群体基因）的整体表现，另一方面深入研究了某些关键“节点”基因的生物学功能，分别从宏观和微观的角度研究了核盘菌各种生物学过程的分子基础。通过以上两种思路和策略，本研究全方位综合展示了核盘菌致病和发育的分子机理，为菌核病的防治提供了新的视野和理论支撑。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1 研究进展

1．1 病原物与植物互作研究

1．2 核盘菌及其危害与防治

1．3 核盘菌菌核形成相关基因的功能研究

1．4 核盘菌致病相关基因的功能研究

1．5 基因功能研究技术

1．6 高通量基因表达分析

2 本研究的目的和意义

第二章 比较基因组揭示转座在核盘菌基因组进化过程中起作用

引言

2．1 材料和方法

2．1．1 基因组数据来源

2．1．2 基因组功能注释

2．1．3 基因组中重复序列和转座元件的注释

2．1．4 核盘菌中类似CENP-B的DDE超家族核酸内切酶和反转录酶的遗传发育分析

2．1．5 核盘菌中类似CENP-B的DDE超家族核酸内切酶和反转录酶的蛋白结构域和模体结构以及基因结构分析

2．1．6 核盘菌中转座元件与类似CENP-B的DDE超家族核酸内切酶和反转录酶编码基因间的关系分析

2．2 结果与分析

2．2．1 基因组功能注释及比较基因组分析结果

2．2．2 转座原件及重复序列比较分析结果

2．2．3 核盘菌中类似CENP-B的DDE超家族核酸内切酶和反转录酶的进化

2．2．4 核盘菌中类似CENP-B的DDE超家族核酸内切酶和反转录酶的蛋白结构域和模体结构以及基因结构

2．2．5 核盘菌中类似CENP-B的DDE超家族核酸内切酶和反转录酶家族成员的扩增和核盘菌基因组中转座元件的关系

2．3 小结

第三章 核盘菌数字基因表达谱分析

引言

3．1 材料和方法

3．1．1 菌株和培养条件

3．1．2 试剂、仪器及DGE测序样品准备

3．1．3 核盘菌数字表达谱的构建

3．1．4 差异表达基因的鉴定

3．1．5 数字表达谱的qRT-PCR验证

3．1．6 数字表达谱分析

3．2 结果与分析

3．2．1 核盘菌的数字表达谱数据及质量评估

3．2．2 差异表达基因的鉴定结果

3．2．3 数字表达谱的qRT-PCR验证结果

3．2．4 致病和菌核形成过程中主要的蛋白家族和结构域

3．2．5 功能谱分析

3．2．6 基因功能富集分析

3．3 小结

第四章 功能谱分析揭示碳固定循环相关基因在核盘菌的发育过程中发挥重要功能

引言

4．1 材料和方法

4．1．1 菌株和培养条件

4．1．2 基因沉默载体的构建和核盘菌的转化

4．1．3 基因表达动态检测

4．1．4 核盘菌基因沉默转化子的表型检测

4．1．5 数据来源

4．1．6 KEGG功能谱分析

4．1．7 碳固定相关基因的遗传发育分析

4．2 结果与分析

4．2．1 DEGG功能谱

4．2．2 qRT-PCR证实数字表达谱中碳固定相关基因的相对表达量

4．2．3 核盘菌中的碳固定相关基因

4．2．4 碳固定相关基因在核盘菌的不同发育阶段受到显著调控

4．2．5 碳固定相关基因在核盘菌的致病力和菌核发育过程中发挥重要作用

4．2．6 碳固定相关基因的进化

4．3 小结

第五章 比较基因组和转录分析揭示碳水化合物活性酶类在植物病原真菌侵染和发育过程中发挥重要作用

引言

5．1 材料与方法

5．1．1 菌株及培养条件

5．1．2 碳水化合物活性酶类及其CBMs的功能注释

5．1．3 数据来源

5．1．4 基因表达聚类分析

5．2 结果与分析

5．2．1 植物病原真菌中碳水化合物活性酶类及其CBMs的比较基因组分析

5．2．2 核盘菌中碳水化合物活性酶类及其CBMs的编码基因的表达模式

5．2．3 禾谷镰刀菌中碳水化合物活性酶类及其CBMs的编码基因在侵染、有性发育和分生孢子萌发过程中的表达模式

5．2．4 青杨锈菌和麦类杆锈菌中碳水化合物活性酶类及其CBMs的编码基因在侵染过程中的转录分析

5．3 小结

第六章 核盘菌候选效应因子的鉴定和小分泌蛋白SsCVNH的功能研究

引言

6．1 材料和方法

6．1．1 候选效应因子的筛选

6．1．2 菌株及其培养条件

6．1．3 本章所用引物

6．1．4 载体构建

6．1．5 蛋白印迹(Western blotting)分析

6．1．6 生物信息学分析

6．2 结果与分析

6．2．1 核盘菌各个发育阶段显著上调的分泌蛋白编码基因的功能富集分析

6．2．2 核盘菌中鉴定出的候选效应因子

6．2．3 SsCVNH预测的蛋白结构

6．2．4 SsCVNH的表达模式

6．2．5 SsCVNH是分泌蛋白

6．2．6 SsCVNH与核盘菌致病力和菌核发育密切相关

6．3 小结和讨论

第七章 核盘菌中小分泌蛋白SsSSVP1的功能研究

引言

7．1 材料和方法

7．1．1 菌株、植物及其培养条件

7．1．2 本章所用引物

7．1．3 载体构建

7．1．4 蛋白质沉淀、透析和浓缩

7．1．5 蛋白印迹(Western blotting)分析

7．1 结果与分析

7．2．1 SsSSVP1的特性

7．2．2 SsSSVP1在核盘菌侵染过程中的表达模式

7．2．3 SsSSVP1的沉默导致核盘菌致病力下降和菌核形成延迟

7．2．4 SsSSVP1超表达转化子的生物学特性

7．2．5 SsSSVP1ΔSP定位于植物细胞的细胞质且能够引起本氏烟的细胞坏死

7．2．6 SsSSVP1能够以不依赖于病原菌的方式被植物细胞内化吸收

7．2．7 SsSSVP1ΔSP能够形成同源二聚体并能够与植物中的QCR8蛋白互作

7．2．8 SsSSVP1中半胱氨酸残基的点突变影响其结构和功能

7．2．9 SsSSVP1ΔSP和QCR8之间的互作干扰QCR8在线粒体上的定位

7．2．10 QCR8的沉默导致植物发育异常和细胞坏死

7．3 小结和讨论

第八章 全文结论和展望

8．1 论文的主要结论

8．1．1 比较基因组和转录组分析揭示核盘菌基因组特性和发育调控机制

8．1．2 功能谱分析及功能研究表明植物碳固定循环“印迹”在核盘菌的发育过程中发挥重要功能

8．1．3 比较基因组和转录分析揭示植物病原真菌中碳水化合物活性酶类及其CBMs在侵染和发育过程中发挥重要作用

8．1．4 分泌蛋白组分析及候选效应因子功能研究证实核盘菌中小分泌蛋白在其与寄主植物的互作中发挥重要作用

8．2 展望

参考文献

附录

论文发表情况

致谢