鲤疱疹病毒Ⅱ与嗜水气单胞菌混合感染致病性研究

摘要

水生动物病毒细菌共感染、或者病毒感染后继发细菌感染在水产养殖业中较为常见，往往较单一感染造成更为严重的的经济损失，但目前尚缺乏混合感染致病机理的研究，严重制约了有效防控措施的制定。鲤疱疹病毒Ⅱ（Cyprinid herpesvirus2, CyHV-2）近年来对我国鲫养殖业造成了巨大威胁，先前的流行病学调查显示与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)混合感染的现象较多。为此，本实验拟构建异育银鲫(Carassius auratus gibelio)的CyHV-2/AH混合感染模型，分析病毒/细菌混合感染的致病效应及其分子机理，为鳃出血病临床防控措施的制定提供理论基础。主要研究结果如下：
　　一、鲤疱疹病毒Ⅱ与嗜水气单胞菌人工感染试验
　　在本研究中，我们对健康异育银鲫进行不同顺序组合的两种病原混合感染，按同时感染AH和CyHV-2、先感染AH后感染CyHV-2和先感染CyHV-2后感染AH三种情况设置以下感染组：AH-CyHV-2-0d；AH-CyHV-2-1d， AH-CyHV-2-3d；CyHV-2-AH-3d， CyHV-2-AH-5d， CyHV-2-AH-9d， CyHV-2-AH-14d。同时设置AH与 CyHV-2单独感染组以及 PBS对照组。AH与 CyHV-2的感染剂量为0.1LD50，统计死亡率。结果显示：AH与 CyHV-2同时感染组与 CyHV-2感染后3d感染 AH组死亡率最高，证明 AH与 CyHV-2间存在协同致死作用；CyHV-2感染后14d感染AH死亡率低于AH单独感染组，说明CyHV-2感染后14d对AH感染存在拮抗作用；其他共感染组死亡率较单独感染组无明显变化。
　　二、CyHV-2感染对免疫相关基因表达的影响
　　以0.1LD50的CyHV-2腹腔注射异育银鲫，对照组注射等量 PBS，在感染后1d、3d、7d和14d分别采集头肾及体肾，，再以荧光定量 PCR法测定感染 CyHV-2后鲫体肾中的病毒载量以及病毒感染前后免疫相关基因（IL-1β、TNFα、IL-6、IL-10、TLR2、IFNγ、TGFβ）的转录变化，结果显示：
　　CyHV-2感染后1d和3d体肾中病毒载量较高，7d时病毒载量明显下降，14d时病毒载量较感染初期显著降低（P＜0.05）。
　　同对照组相比，CyHV-2感染后第1d，IL-1β2在头肾中表达水平显著上升（P＜0.05），其他基因表达水平无显著变化； CyHV-2感染后第3d，IL-1β1在头肾中的表达水平显著下降（P＜0.05），在体肾中的表达水平极显著下降（P＜0.01）；CyHV-2感染后第7d，IFNγ在头肾中表达水平显著上升（P＜0.05），在体肾中表达水平显著下降（P＜0.05）；TGFβ在体肾中表达水平极显著下降（P＜0.01）；TLR2在体肾中表达水平极显著上升（P＜0.01）；CyHV-2感染后第14d，IL-1β2在体肾中表达水平显著上升（P＜0.05）。

目录

声明

缩略词表

第一章文献综述

1.1混合感染及其危害

1.2水产动物常见混合感染类型及互作关系

1.2.1病毒间混合感染

1.2.2细菌、真菌和寄生虫间的混合感染

1.2.3细菌和病毒间的混合感染

1.3鲤疱疹病毒Ⅱ与嗜水气单胞菌的流行现状及感染机制

1.3.1鲤疱疹病毒Ⅱ

1.3.1嗜水气单胞菌

1.4本实验研究目的与意义

第二章鲤疱疹病毒Ⅱ与嗜水气单胞菌人工感染试验

2.1材料与方法

2.1.1病毒和细菌

2.1.2实验鱼及试验条件

2.1.3主要试剂和溶液

2.1.4实验仪器

2.1.5 CyHV-2荧光定量标准曲线构建

2.1.6 CyHV-2半数致死量的测定

2.1.7 AH半数致死量的测定

2.1.8混合感染实验设计

2.2结果与分析

2.2.1基于TK基因的荧光定量标准曲线构建

2.2.1 CyHV-2半数致死量的测定

2.2.3 AH半数致死量的测定

2.2.4 CyHV-2/AH混合感染的累计死亡率

2.2.5 AH/CyHV-2顺序感染的继发死亡率

2.2.6 CyHV-2/AH顺序感染的继发死亡率

2.3讨论

2.3.1 AH/CyHV-2顺序感染的继发死亡率试验

2.3.2 CyHV-2/AH顺序感染的继发死亡率试验

第三章CyHV-2感染对免疫相关基因表达的影响

3.1材料与方法

3.1.1病毒与实验鱼及试验条件

3.1.2试验设计

3.1.3样品收集

3.1.4组织DNA的提取

3.1.5提取组织总RNA

3.1.6 RNA的定性与定量分析

3.1.7 cDNA的制备

3.1.8引物设计与PCR反应

3.1.9数据分析

3.2结果与分析

3.2.1体肾中CyHV-2的载量变化

3.2.2头肾中免疫相关基因的表达

3.2.3体肾中免疫相关基因的表达

3.3讨论

参考文献

致谢