泛素特异性蛋白酶USP15调控Ⅰ型干扰素的机制研究以及PRRSV感染细胞的泛素化蛋白质组学

摘要

泛素化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，是指单个或多个泛素分子连接到目标蛋白赖氨酸(Lys)残基上的修饰过程，需要E1泛素激活酶、E2泛素结合酶以及E3泛素连接酶的共同参与。在细胞生命过程中起着重要调控作用，涉及细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤修复、蛋白相互作用以及信号转导等方面。
　　干扰素(IFN)是宿主抗病毒感染的重要防御机制，也是当前抗病毒天然免疫研究的重点。Ⅰ型干扰素表达异常会引发相关的免疫疾病，因此严格调控Ⅰ型干扰素对于维持机体的免疫稳态十分重要。泛素化作为一种热门并且关键的翻译后修饰，在干扰素产生及其信号转导中扮演着关键角色。泛素特异性蛋白酶(USPs)是家族成员数目最多的去泛素化酶(DUBs)，正受到广泛的关注，其功能和结构因家族成员众多而存在多样性。本实验以USP15作为研究对象，深入探究其在调节Ⅰ型干扰素信号通路中的作用，为扩充USPs家族的生物学功能提供理论基础。
　　泛素化修饰不仅调节细胞内多项生理功能，还参与调控多种病毒的复制与增殖过程，如牛病毒性腹泻病毒基因组有泛素和类泛素基因;轮状病毒等利用泛素蛋白酶体途径调节自身复制;人免疫缺陷病毒等编码蛋白可以发生泛素化修饰;流感病毒等通过编码具有E3泛素连接酶活性的蛋白或者其他途径调控细胞内蛋白的泛素化修饰。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是危害当前养猪业的重要病原，其免疫机制十分复杂。目前关于泛素化修饰在PRRSV感染与免疫中的作用尚不清楚。因此本研究利用蛋白质组学技术对PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)前后泛素化修饰进行了定量分析，揭示泛素化修饰在PRRSV感染与致病性方面发挥的重要作用。具体研究内容如下:
　　1.泛素特异性蛋白酶USP15调控Ⅰ型干扰素的机制研究
　　在我们前期通过siRNA筛选调控干扰素的泛素特异性蛋白酶时，发现干扰USP15后可以上调ISRE启动子活性，因此对其进行进一步研究。干扰分子干扰内源性USP15基因后仙台病毒诱导的IFN-β表达（启动子水平，mRNA水平以及蛋白水平）、IRF3和NF-κB启动子活性及磷酸化修饰、ISRE启动子活性及干扰素刺激基因(ISGs)的表达都有明显上调，而在细胞内超表达USP15后则呈现显著的抑制效果。此外，还通过观察对干扰素高度敏感的水泡性口膜炎病毒(VSV-GFP)的增殖情况，证实超表达USP15可以显著抑制干扰素的产生。进一步的体外及体内去泛素实验证实USP15具有去泛素活性且活性位点是第269位C（半胱氨酸）及862位H（组氨酸）。免疫共沉淀实验发现，USP15可以特异性去除RIG-Ⅰ K63形式偶联的多聚泛素。通过分析USP15的突变体，发现USP15 DUB活性位点突变后其抑制IFN-β活性的能力显著降低但并未完全丧失，表明USP15抑制干扰素产生需要但不完全依赖其DUB活性。同时，还发现USP15可以与RIG-Ⅰ直接相互作用，并且竞争性抑制RIG-Ⅰ对IPS-1的募集，而且DUB活性位点突变的USP15突变体同样可以通过与RIG-Ⅰ发生相互作用进而减弱RIG-Ⅰ与IPS-1之间的结合，进一步证实USP15可以通过不依赖去泛素化活性的方式抑制干扰素产生。因此，USP15可以通过两种不同的机制抑制干扰素产生及其信号通路:(1) USP15特异性去除RIG-Ⅰ K63形式连接的多聚泛素;(2) USP15竞争性抑制RIG-Ⅰ对IPS-1的募集作用。
　　2.PRRSV感染细胞的泛素化蛋白质组学
　　将PRRSV WUH3株感染猪原代肺泡巨噬细胞，于感染后36h收集被感染细胞，利用Label-free技术，结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)，对PRRSV感染细胞泛素化修饰的变化情况进行检测和分析。共鉴定出315个蛋白的431个泛素化位点修饰显著上调，402个蛋白的552个泛素化位点修饰显著下调。通过生物信息学技术对修饰存在显著差异蛋白的亚细胞定位、生物学功能、KEGG代谢通路等进行分析，发现修饰显著差异蛋白与蛋白酶体降解、蛋白定位以及能量代谢等多种生物进程相关，并且发生泛素化修饰的motif有3种，分别为:KubXXP、RXXXXLXKub和KubQ。将PRRSV WUH3株感染PAM细胞后的差异蛋白质组学与泛素化修饰组学进行关联分析，证实泛素化修饰与蛋白表达量之间没有明显的关联。通过对修饰存在显著差异蛋白的生物学功能进行深入分析，发现许多蛋白与干扰素信号通路、NF-κB信号通路相关，如TRAF6、IL-1β、HMGB1、JAK1、Mx2以及ISG15等，表明泛素化修饰的改变在PRRSV调控干扰素及炎症反应中起到了关键作用。同时，还发现PRRSV编码的15种蛋白(nsp1β、nsp2、nsp3、nsp4、nsp7、nsp8、nsp9、nsp10、nsp11、nsp12、ORF2a、ORF3、ORF5、ORF6、ORF7)的64个位点存在泛素化修饰，包括参与RNA合成、诱导中和抗体产生以及决定病毒感染力的非结构蛋白与结构蛋白，而且还发现泛素蛋白酶体途径抑制剂处理PAM细胞后PRRSV的增殖受到明显抑制，提示泛素化修饰可能在PRRSV的转录、复制以及蛋白合成中发挥作用。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

第1章 文献综述

1．1 抗病毒天然免疫

1．1．1 病毒诱导Ⅰ型干扰素产生信号通路

1．1．2 Ⅰ型干扰素介导抗病毒作用

1．2 天然免疫中的泛素化与去泛素化

1．2．1 泛素化修饰简介

1．2．2 泛素化修饰参与调控抗病毒天然免疫

1．2．3 去泛素化酶

1．2．4 去泛素化酶参与调控抗病毒天然免疫

1．3 病毒与泛素化修饰

1．3．1 泛素蛋白酶体途径参与病毒复制

1．3．2 病毒蛋白的泛素化修饰

1．3．3 病毒蛋白参与调控天然免疫信号通路中的泛素化修饰

1．4 猪繁殖与呼吸综合征研究进展

第2章 泛素特异性蛋白酶USP15调控Ⅰ型干扰素的机制研究

2．1 研究目的与意义

2．2 实验材料

2．2．1 细胞、毒株、菌株

2．2．2 载体与质粒

2．2．3 工具酶、siRNA及主要试剂

2．2．4 Western blot及Co-IP所需实验材料

2．2．5 培养基及其配制

2．2．6 主要缓冲液与相关试剂及其配制

2．2．7 主要实验仪器及设备

2．3 实验方法

2．3．1 RNA提取

2．3．2 USP15表达质粒的构建

2．3．3 双荧光素酶检测实验

2．3．4 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测基因mRNA水平

2．3．5 Western blot及Co-IP实验

2．3．6 体外去泛素化实验

2．3．7 蛋白表达与纯化

2．3．8 GST pulldown实验

2．3．9 统计学方法

2．4 结果与分析

2．4．1 USP15负调控Ⅰ型干扰素免疫应答

2．4．2 USP15去泛素活性鉴定

2．4．3 USP15可以去除RI-Ⅰ的泛素化修饰

2．4．4 USP15特异性去除RIG-Ⅰ K63连接形式的泛素化修饰

2．4．5 USP15负调控RIG-Ⅰ激活的干扰素表达

2．4．6 USP15抑制干扰素产生不完全依赖于去泛素化活性

2．4．7 USP15与RIG-Ⅰ存在相互作用

2．4．8 USP15竞争性抑制RIG-Ⅰ对IPS-1的募集作用

2．4．9 USP15可以通过不依赖去泛素化活性的机制负向调控干扰素产生

2．5 讨论

2．5．1 USP15通过去除RIG-Ⅰ K63连接形式的泛素化负向调控干扰素产生

2．5．2 USP15通过竞争性抑制RIG-Ⅰ对IPS-1的募集负向调控干扰素产生

2．5．3 其他团队的相关研究

第3章 PRRSV感染细胞的泛素化蛋白质组学

3．1 研究目的与意义

3．2 实验材料

3．2．1 实验动物

3．2．2 细胞与毒株

3．2．3 质粒

3．2．4 主要试剂

3．2．5 抗体及Western blot所需实验材料

3．2．6 细胞培养基及其配制

3．2．7 主要缓冲液与相关试剂及其配制

3．2．8 主要实验仪器及设备

3．3 实验方法

3．3．1 原代PAM细胞的分离

3．3．2 PRRSV的增殖

3．3．3 病毒滴度的测定

3．3．4 间接免疫荧光与激光共聚焦显微镜的观察

3．3．5 用于蛋白质组学分析的细胞样品的制备

3．3．6 全细胞蛋白质的提取

3．3．7 蛋白质的酶解

3．3．8 高效液相色谱分离

3．3．9 富集泛素化肽段

3．3．10 LC-MS／MS分析

3．3．11 生物信息学分析

3．3．12 Western blot及Co-IP实验

3．4 结果与分析

3．4．1 PRRSV感染PAM细胞动力学分析

3．4．2 蛋白质的定量信息及泛素化修饰差异蛋白的筛选

3．4．3 泛素化修饰差异蛋白的亚细胞注释

3．4．4 泛素化修饰差异蛋白的GO及KEGG通路分析

3．4．5 修饰位点Motif分析

3．4．6 差异蛋白质组学与泛素化修饰组学关联分析

3．4．7 PRRSV编码蛋白的泛素化修饰

3．4．8 泛素蛋白酶体系统对PRRSV增殖是必须的

3．5 讨论

3．5．1 PRRSV感染影响NF-κB信号通路中蛋白的泛素化修饰

3．5．2 PRRSV感染影响Ⅰ型干扰素信号通路中蛋白的泛素化修饰

3．5．3 PI汛SV编码蛋白可以发生泛素化修饰

第4章 结论

参考文献

致谢

附表

个人资料

教育经历

在读期间发表的主要文章