团头鲂4个补体基因表达分析及Bf/C2A基因SNP开发与鉴定

摘要

团头鲂（Megalobrama amblycephala）是我国特有的重要淡水经济养殖鱼类之一。近些年，随着养殖规模扩大和集约程度加深，养殖环境不断恶化，使得其疾病频繁发生。其中，势头最猛、危害性最强的当属细菌性败血症，其病原菌为嗜水气单胞菌。补体（complement，C）是经活化后具有酶活性的蛋白质，主要存在于动物血清与组织液中，是免疫系统的重要组成部分。对团头鲂补体相关基因进行研究，探究其与鱼类抗病力关系，将为团头鲂抗病分子育种提供重要的理论基础。本研究从团头鲂全基因组数据中钓取得到补体Bf/C2（Bf/C2A和Bf/C2B）、DF和PF4个Unigene，对其进行了克隆验证和表达研究。主要研究结果如下：
　　1、团头鲂Bf/C2A和Bf/C2B基因序列验证及表达分析
　　扩增到团头鲂Bf/C2A基因cDNA全长共2520 bp，其中5' UTR42 bp、ORF2298 bp、3' UTR180 bp，编码765个氨基酸。Blastp分析显示，该基因与鲤B/C2-A2基因相似性最高。CDD结构域预测显示，该基因包含4个结构域：2个补体调节蛋白结构域CCP，1个血管性血友病因子A结构域vWFA以及1个胰蛋白酶结构域 Tryp_SPc。对团头鲂不同胚胎期样品进行荧光定量 qRT-PCR，结果显示Bf/C2A基因在出膜后1 d表达量最高，在肠管形成期和出膜期表达量次之，在其他时期表达量都比较低。对健康团头鲂不同组织进行荧光定量qRT-PCR，结果显示该基因在肝脏、脾脏、肾脏、肠、鳃、心脏、脑、肌肉、血液和头肾10个组织中均有表达，且在肝脏中表达量最高。细菌感染后各免疫组织中的表达量都有显著变化，总体趋势相比对照组均有显著上升。
　　扩增到团头鲂Bf/C2B基因cDNA全长共2131 bp，均为ORF片段，编码710个氨基酸。Blastp分析显示，Bf/C2B基因与草鱼Bf/C2B基因相似性最高。CDD结构域预测显示，该基因包含6个结构域：4个补体调节蛋白结构域CCP，1个血管性血友病因子A结构域vWFA以及1个胰蛋白酶结构域Tryp_SPc。对团头鲂不同胚胎期样品进行荧光定量qRT-PCR，结果显示Bf/C2B基因在出膜后1 d表达量最高，在肠管形成期和囊胚期表达量次之，在其他时期表达量都比较低。对健康团头鲂不同组织进行荧光定量qRT-PCR，结果显示团头鲂Bf/C2B基因在肝脏、脾脏、肾脏、肠、鳃、心脏、脑、肌肉、血液和头肾10个组织中均有不同程度的表达，在肝脏表达量最高，其次是肾脏、头肾、脾脏和肌肉，其余组织中表达量都很低。嗜水气单胞菌感染后，肝脏和脾脏表达量均显著上升。
　　2、团头鲂DF基因序列验证及表达分析
　　扩增到团头鲂DF基因cDNA全长共780 bp，其中5' UTR23 bp、ORF753 bp、3' UTR4 bp，编码250个氨基酸。Blastp分析显示，该基因与草鱼DF基因相似性最高。CDD结构域预测显示，该基因只有1个结构域：即Bf/C2A、Bf/C2B都有的胰蛋白酶结构域 Tryp_SPc。对团头鲂不同胚胎期样品进行荧光定量qRT-PCR，结果显示DF基因在肠管形成期表达量最高，在出膜期和出膜后1 d表达量也相对较高，在眼球色素出现期表达量次之，在其他时期表达量都比较低。对健康团头鲂不同组织进行荧光定量qRT-PCR，结果显示DF基因在检测的所有组织中都有不同程度的表达，在肾脏中表达量最高，其次是脑和鳃，在血液中表达量最低。团头鲂DF基因在细菌感染后各组织中的表达量都有较大变化。其中，在肝脏和头肾中变化趋势相似，均在24 h时候达到最大值；在脾脏中3 d时候达到最大值。
　　3、团头鲂PF基因序列验证及表达分析
　　扩增到团头鲂PF基因cDNA全长共1366 bp，其中5' UTR19 bp、ORF1329 bp、3' UTR18 bp，编码442个氨基酸。Blastp分析显示，该基因与鲤PF基因相似性最高，为71％。CDD结构域预测显示，该基因有4个结构域：即3个凝血酶敏感蛋白1型结构域TSP1和1个凝血酶敏感蛋白1型超级家族结构域TSP_1 super family。对团头鲂不同胚胎期样品进行荧光定量qRT-PCR，结果显示PF基因在肠管形成期表达量最高，在出膜后1 d、出膜后7d和出膜后10 d表达量较高，在出膜期和出膜后15 d表达量次之，在其他时期表达量都较低。对健康团头鲂不同组织进行荧光定量qRT-PCR，结果显示PF基因在检测的所有组织中都有不同程度的表达。其中，在头肾中表达量最高，其次是肾脏和肝脏，在肌肉中表达量最低。团头鲂PF基因在细菌感染后各组织中的表达量都有受到抑制的情况。其中，肝脏、脾脏和头肾在刚开始注射嗜水气单胞菌感染后24 h前受到抑制，随后表达量上升；而肾脏中，其表达量12 h前呈上升趋势，而后逐渐下降。
　　4、Bf/C2A基因SNP位点开发及鉴定
　　通过PCR扩增、测序和序列比对得到了团头鲂Bf/C2A基因的SNP位点34个，其中启动子部分4个，外显子部分19个，内含子部分11个。通过筛选得到2个可以设计HRM分型引物的位点。以起始密码子ATG位点为+1，这2个位点分别为：1518C/T和7567G/C。其中7567G/C位点位于内含子部分，1518C/T位点位于外显子部分。用HRM（High resolution melting）法对2个位点在抗病组和易感组各100个样本中进行了基因分型，经过统计分析，发现1518C/T位点突变在易感组和抗病组之间具有显著差异，拥有CT基因型的个体明显比拥有CC和TT基因型的个体抗病。

目录

声明

缩略语表

第一章 文献综述

1 研究问题的由来

2 国内外研究综述

2.1 补体系统

2.2基因多态性检测方法

2.3 SNP在水产研究中的应用

3 研究的目的和意义

1 前言

2 材料与方法

3 结果与分析

4讨论

第二节 团头鲂DF基因生物信息学及表达分析

1 前言

2 材料与方法

3 结果与分析

4讨论

第三节 团头鲂PF基因生物信息学及表达分析

1 前言

2材料与方法

3 结果与分析

4讨论

第三章 团头鲂Bf/C2A基因SNP位点开发与鉴定

1前言

2材料与方法

2.1 实验材料

2.2 主要仪器设备及试剂

2.3 DNA提取（酚-氯仿法）

2.4 Bf/C2A基因SNP位点获得

2.5 HRM法SNP分型

2.6 Bf/C2A基因SNP多态性与抗细菌性败血症的关联分析

3结果与分析

3.1 样品的采集

3.2 DNA提取结果

3.3 Bf/C2A基因结构分析

3.4 Bf/C2A SNP位点的获得

3.5 Bf/C2A基因SNP多态性与抗病的关联分析

4讨论

小结

参考文献

附录

致谢