犬博卡病毒GZHD15株全基因序列分析及PCR检测方法的建立与应用

摘要

博卡病毒是一种可感染多种动物的小DNA病毒。近年来的研究逐步增多，主要是针对人博卡病毒（HBoV）、猪博卡病毒（PBoV）、牛博卡病毒（BPV）的检测方法、基因分型、细胞培养技术、致病性等方面的研究。但基因型复杂、检测方法滞后、致病机制报道很少，严重限制博卡病毒流行调查、防控技术储备，尤其是犬博卡病毒(CBoVs)的研究相对较少。因此，本课题对实验室保存的犬博卡病毒株GZHD15进行全基因序列分析，并建立PCR检测方法。初步掌握了CBoVs在国内地区性的流行情况，对提高检测水平及CBoVs更深层次的研究提供基础的科学数据资料和思路，具有科学价值和意义。
　　本课题选择实验室保存的犬博卡病毒株GZHD15，对其进行分段扩增全基因组，再全基因组克隆，对测序结果进行拼接，获得一条全长5116bp的基因序列，将其与NCBI中的所有完整的CBoVs基因序列和其它博卡病毒部分完整基因序列构建进化树，经分析发现GZHD15株与CBoV2的亲缘关系最近，在CBoV2中，GZHD15株与香港株（登录号：JQ692588-JQ692590）和韩国株（登录号：KP281717）亲缘关系最近。运用NCBI中的在线软件对其进行开放阅读框（Open reading frame, ORF）预测，GZHD15株同其它CBOVs一样，共3个ORF，分别编码非结构蛋白NS1、NP1，结构蛋白VPI、VP2。在与NCBI中25条完整CBoVs基因全长比对中，GZHD15株与15株CBoV2的核苷酸同源性在92.6％-96.8%，与MVC同源性普遍低于61.2%，与CBoV3同源性55.7%。与26条CBoVs基因序列的病毒蛋白NS1、NP1、VP1、VP2进行核苷酸和氨基酸同源性对比，结果和整体基因序列的比对结果保持一致。
　　参考CBoVs结构蛋白VP2的基因序列，用引物设计软件Primer premier5.0设计一对检测引物，建立PCR检测方法，分别从退火温度、引物用量两方面对检测方法进行优化，并通过特异性实验、敏感性实验、重复性实验验证优化后的检测方法的准确性。运用优化后的PCR检测方法对广州市CBoVs的流行情况做了初步的调查，425份被检样品中仅测得1份阳性，经测序结果分析比对，该病毒株属于CBoVs。对初步调查结果进行分析，认为与样品的采集季节有很大关系。

目录

声明

缩略词

1.前言

1.1研究问题的由来

1.2 博卡病毒概况

1.3 犬博卡病毒

1.4 研究目的及意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

3 结果与分析

3.1 GZHD15株全基因序列分析

3.2 犬博卡病毒（CBoVs）PCR检测方法的建立

3.3 广州市犬博卡病毒（CBoVs）流行病学初步调查

4 讨论

4.1 GZHD15株全基因序列分析

4.2 犬博卡病毒（CBoVs）PCR检测方法的建立

4.3 广州市犬博卡病毒（CBoVs）流行病学初步调查

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢