茯苓磷酸甲羟戊酸激酶基因克隆及功能分析

摘要

茯苓是一种药食两用、大宗的常用中药材，是高等真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，有茯苓与茯苓皮两味药材。三萜类化合物是其主要活性成分之一，具有抗肿瘤、抗氧化、抗惊厥等多种生物活性。茯苓通过甲羟戊酸途径(MVA pathway)合成萜类骨架，并进一步形成各种活性萜类物质。5-磷酸甲羟戊酸激酶(phosphomevalonate kinase)是MVA途径的第5个酶，其能催化5-磷酸甲羟戊酸(MVAP)形成5-焦磷酸甲羟戊酸的反应及其逆反应，是MVA到IPP途径中的限速步骤;其基因表达量较低，且受下游产物的调节，是整个萜类合成途径中的重要调节位点之一。本研究克隆出茯苓磷酸甲羟戊酸激酶基因(PcPMK)，通过酵母功能互补和体外酶促反应验证基因功能，并进行了相关酶动力学研究。主要研究结果如下:
　　1成功克隆PcPMK基因利用系列方法获得具有完整ORF的茯苓磷酸甲羟戊酸激酶基因(PcPMK) mRNA序列1662bp，基因组DNA序列3249bp;基因具有6个内含子、7个外显子，启动子区具有ABA、生长素、MYB等多种转录调控位点。基因编码具有511个氨基酸，预测分子量54.8kDa的不稳定疏水性蛋白PcPMK。PcPMK蛋白序列与真菌同源性较高，系统发育分析表明，蛋白的聚类结果与物种分类地位一致。蛋白具有与活性相关的P-loop等3个保守功能域，且这些功能域在模拟的PcPMK3D结构上相邻，具有典型GHMP家族蛋白的特征。
　　2 PcPMK基因能互补酵母ERG8基因功能构建酵母表达载体pYES2-pcpmk，转化至ERG8杂合突变型酿酒酵母菌株中。优化产孢条件后，菌株在McClary培养基上25℃产孢培养15天，取细胞经30mg/mL蜗牛酶30℃酶解约60min后，进行四分体单孢分离，并利用营养表型和交配型PCR验证得到目的单倍体酵母菌株。目的菌株定量接种到5种不同的培养基上，进行基因功能互补展示，得到预期互补结果，证明克隆得到的PcPMK基因具有PMK基因活性。
　　3重组PcPMK蛋白具有5-磷酸甲羟戊酸激酶功能构建原核表达载体pCold-pcpmk，并转化至E.coli表达菌株BL21(DE3)，优化了蛋白表达条件，并利用优化后的蛋白纯化方法得到纯化后PcPMK蛋白。利用原核表达纯化的PcPMK蛋白、底物MVAP和ATP进行体外酶促反应，UPLC-MS分析反应产物中有目的产物5-焦磷酸甲羟戊酸和ADP的生成，证明表达的重组PcPMK蛋白具有ATP:5-磷酸甲羟戊酸磷酸转移酶催化功能。
　　4 PcPMK是一种Mn2+依赖型酶进一步对PcPMK蛋白进行酶动力学研究表明，PcPMK是一种Mn2+依赖型酶，Mg2+也能部分激活其活性。PcPMK酶对ATP的浓度敏感，高浓度ATP能抑制酶活性。利用丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联的微孔板连续监测法测定PcPMK酶活性:对于底物ATP，酶的米氏常数Km为67.7±7.5μmol/L，最大反应速率Vmax为6.21±0.19μmol/min/mg蛋白;对MVAP的Km为104.3±9.8μmol/L,Vmax为6.75±0.18μmol/min/mg蛋白。
　　综上所述，本研究克隆出PcPMK基因，综合酵母功能互补、体外酶促反应验证了其功能。利用各种生物信息学分析工具和手段对PcPMK基因及蛋白进行了较为系统的分析，模拟得到PcPMK蛋白的3D结构。发现了PcPMK对Mn2+的依赖性，测定了其对底物MVAP和ATP的酶动力学参数。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 前言

1．1 茯苓萜类物质研究进展

1．1．1 茯苓概述

1．1．2 茯苓的药理作用概述

1．1．3 茯苓的化学成分

1．1．4 茯苓萜类生物合成研究进展

1．2 磷酸甲羟戊酸激酶研究进展

1．2．1 萜类物质概述

1．2．2 萜类骨架生物合成代谢

1．2．3 磷酸甲羟戊酸激酶的生化功能

1．2．4 磷酸甲羟戊酸激酶在萜类代谢中的调控作用

1．3 研究意义与技术路线

1．3．1 研究意义

1．3．2 本研究的技术路线

2 茯苓磷酸甲羟戊酸激酶基因(PcPMK)的克隆及序列分析

2．1 材料与方法

2．1．1 试验材料

2．1．2 菌株和载体

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器设备

2．1．5 核酸提取

2．1．6 第一链cDNA合成

2．1．7 PcPMK基因片段获取

2．1．8 3’RACE

2．1．9 5’RACE

2．1．10 PcPMK基因全长扩增

2．1．11 PcPMK基因组DNA序列获得

2．1．12 PcPMK基因生物信息学分析

2．2 结果与分析

2．2．1 PcPMK基因的分子克隆

2．2．2 PcPMK基因结构与启动子分析

2．2．3 PcPMK蛋白质系统发育分析

2．2．4 PcPMK蛋白质理化性质预测分析

2．2．5 PcPMK蛋白质3D结构模拟与功能分析

2．3 小结与讨论

2．3．1 小结

2．3．2 讨论

3 茯苓PcPMK基因的酵母功能互补

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株和载体

3．1．2 主要试剂

3．1．3 主要仪器设备

3．1．4 酵母表达载体的构建及酵母转化

3．1．5 酵母产孢培养及四分体单孢分离

3．1．6 PcPMK基因功能互补展示

3．2 结果与分析

3．2．1 酵母表达载体的构建

3．2．2 酵母单倍体菌株分离

3．2．3 PcPMK基因酵母功能互补

3．3 小结与讨论

3．3．1 小结

3．3．2 讨论

4 茯苓磷酸甲羟戊酸激酶体外酶活验证及酶动力学研究

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株和载体

4．1．2 主要试剂、耗材

4．1．3 主要仪器设备

4．1．4 原核表达载体的构建

4．1．5 PcPMK蛋白表达及纯化

4．1．6 PcPMK功能的体外酶促反应验证

4．1．7 PcPMK的酶动力学研究

4．2 结果与分析

4．2．1 PcPMK蛋白表达与纯化

4．2．2 重组PcPMK的体外活性

4．2．3 不同Mn2+和Mg2+浓度对PcPMK酶活力的影响

4．2．4 PcPMK酶动力常数

4．3 小结与讨论

4．3．1 小结

4．3．2 讨论

5 结论和展望

5．1 结论

5．2 展望

5．3 本文创新点

参考文献

附录

攻读硕士学位期间主要学术成果

致谢