三种梨病毒实时荧光定量Rt-PCR和Rt-LAMP检测技术的研究

摘要

苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pittingvirus，ASPV)和苹果褪绿叶斑病毒(Apple cholortotic leaf spot virus，ACLSV)是侵染梨树的三种主要病毒，单一病毒侵染栽培梨时，通常不表现出明显的症状，而两种或三种病毒复合侵染时，有的梨树叶片表现出褪绿斑、脉黄、畸形及卷曲等明显症状。目前，培育和栽培无病毒苗木是防治果树病毒病的有效措施，因此，果树病毒病的检测和诊断具有非常重要的作用。建立灵敏、快速和高通量的病毒检测可为无病毒种苗的繁育提供技术。本研究建立了检测3种梨病毒ASGV、ASPV和ACLSV的实时荧光定量RT-PCR(Reverse transcriptional real time fluorescent quantitative，qRT-PCR)技术及ASPV和ACLSV的环介导等温扩增(Reverse transcriptionloop-mediated isothermal amplification, RT-LAMP)技术，研究结果如下:
　　1、本研究依据ASGV、ASPV和ACLSV的cp基因序列，分别设计了6对、9对和9对用于这3种梨病毒的qRT-PCR检测引物，从中筛选出检测效果稳定的3对引物:ASGV-F6/R6、ASPV-F8/R8和ACLSV-f5/r5。分别以含有3种病毒的cp基因的质粒为模板，通过设置不同梯度，发现引物用量和退火温度对qRT-PCR的影响较大。确定最佳引物浓度均为0.15 pmol/μl，退火温度均为58℃。采用qRT-PCR引物，检测ASGV、ASPV和ACLSV的灵敏度分别是RT-PCR的103倍、103倍和102倍，可检测梨离体植株中3种病毒的最低cDNA浓度均为4×10-3 ng/μl。
　　2、采用建立的qRT-PCR技术对22株梨离体植株和40株田间梨叶片进行病毒检测。结果显示，梨离体植株ASGV、ASPV和ACLSV的阳性率为68.2％、50.0％和4.5％，ASGV和ASPV的检出率均比RT-PCR高9.1％，ACLSV的检出率相当;田间梨样品ASGV、ASPV和ACLSV的阳性率为35.0％、7.5％和5.0％，ASPV和ACLSV检出率均高2.5％，ASGV的检出率一致。
　　3、设计了5组和6组用于检测ASPV和ACLSV的LAMP引物，以阳性梨离体叶片为材料，从中筛选出2种病毒检测效果稳定的引物，即检测ACLSV的引物为ACLSV-6-F3/R3和ACLSV-6-FIP/BIP，检测ASPV的引物为ASPV-5-F3/B3和ASPV-5-FIB/BIP。分析了dNTP、Mg2+、甜菜碱的浓度和外引物与内引物浓度比及反应时间和温度检测效果的影响，建立了检测ASPV和ACLSV的LAMP扩增体系。这2种病毒的灵敏度均是RT-PCR技术的104倍，可从梨离体植株的最低总RNA浓度为10-4 ng/iμl和10-3 ng/μl中检测到ACLSV和ASPV。对扩增产物分别采用SYBRGreenⅠ染料直接观察法和琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示，反应前加入染料可直接观察产物，其灵敏度比琼脂糖凝胶电泳法高出10倍。
　　4.采用已建立的2种病毒的RT-LAMP技术，随机选取20个梨组培苗和22株田间梨样品，检测到梨离体植株ASPV和ACLSV的阳性率为45.0％和15.0％，ACLSV的检测率一致，而ASPV的检出率比RT-PCR技术高5.0％;田间梨样品ASPV和ACLSV的检出率为40.9％和36.4％，ASPV和ACLSV的检出率比RT-PCR技术分别高4.5％和4.6％。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviations)

第一章 文献综述

1．1 三种梨病毒的危害特点

1．2 三种梨病毒的分子特性

1．3 果树病毒检测技术研究进展

1．3．1 核酸分子杂交技术

1．3．2 双链RNA(dsRNA)技术

1．3．3 基因芯片技术

1．3．4 实时荧光定量PCR技术

1．3．5 LAMP技术

1．4 研究目的和意义

第二章 三种梨病毒实时荧光定量RT-PCR检测技术

2．1 材料

2．1．1 供试材料

2．1．2 试剂及仪器

2．2 研究方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 总RNA的提取

2．2．3 Dnase I消化

2．2．4 RT-PCR扩增

2．2．5 基因克隆

2．2．6 引物用量及反应温度的优化

2．2．7 阳性质粒标准品的构建

2．2．8 标准曲线的绘制

2．2．9 qRT-PCR引物特异性检测

2．2．10 qRT-PCR引物灵敏度验证

2．3 结果与分析

2．3．1 三种梨病毒qRT-PCR检测引物的筛选

2．3．2 引物用量对PCR扩增反应的影响

2．3．3 温度梯度对PCR扩增反应的影响

2．3．4 溶解曲线的分析

2．3．5 标准曲线的绘制

2．3．6 重复性

2．3．7 qRT-PCR检测ASGV、ASPV和ACLSV效果评价

2．3．8 qRT-PCR检测梨三种病毒的效果

2．4 结果与讨论

第三章 ACLSV和ASPV两种病毒的RT-LAMP技术

3．1 材料与方法

3．1．1 供试材料

3．1．2 主要试剂与仪器

3．2 研究方法

3．2．1 引物设计

3．2．2 总RNA提取

3．2．3 RT-PCR扩增

3．2．4 RT-LAMP反应体系的建立及优化

3．2．5 LAMP扩增产物检测

3．2．6 RT-LAMP特异性检测

3．2．7 RT-LAMP检测引物灵敏度验证

3．3 结果与分析

3．3．1 ACLSV和LAMP检测引物的筛选

3．3．2 RT-LAMP检测ACLSV和ASPV反应体系的优化

3．3．3 RT-LAMP检测ACLSV和ASPV效果评价

3．3．4 RT-LAMP检测梨样品

3．4 结果与讨论

第四章 结论与展望

参考文献

附录

致谢