Z染色体miRNAs在早期不同性别鸡胚中的表达及miR-2954的功能分析

摘要

细胞自主性别决定学说认为Z染色体基因的剂量决定鸡的性别，但确切的决定因子还未知。已有研究表明性染色体miRNAs在哺乳动物生殖发育方面有着重要作用。因此，我们推测鸡Z染色体miRNA可能在鸡性别决定及性分化中起着重要的调控作用。本研究在课题组前期工作基础上，首先通过定量PCR的方法分析了10个Z染色体差异表达miRNAs在E2-E8.5的雌、雄鸡胚或性腺中的时间表达模式，然后检测了雄性高表达的miR-2954在E10.5鸡胚各组织中的表达模式，进而通过双荧光素酶报告基因系统及miRNA超表达和抑制实验研究了miR-2954与靶基因的调控关系。本研究所取得的结果如下:
　　1.Z染色体miRNAs在早期雌、雄鸡胚或性腺中的表达结果表明，miR-2954、novel-miR-66和novel-miR-37等七个miRNAs总体上表现为雄性高表达，miR-122-5p在E2.5-E4.5鸡胚中为雄性高表达，而在E5.5-E8.5鸡胚性腺中雌性高表达，miR-2131-5p在E3-E6.5为雌性高于或显著高于雄性;而miR-31-3p在整个时期表达规律不明显，呈连续锯齿状变化。
　　2.miR-2954在鸡胚中的发育及组织的表达谱结果表明，它在E2-E8.5鸡胚及性腺中八个时期和E10.5鸡胚八种组织中的表达均为雄性显著或极显著高于雌性。
　　3.通过软件对miR-2954进行靶基因预测，再结合靶基因功能分析以及miRNA-靶基因结合结构分析，初步确定了YY1和FOXD1基因为miR-2954的候选靶基因。并利用双荧光素酶报告基因系统对预测的靶基因进行了初步验证，检测结果说明YY1与FOXD1均为miR-2954的靶基因。
　　4.运用定量PCR方法检测了YY1基因在E2-E8.5雌、雄鸡胚及E10.5鸡胚各组织中的表达，结果表明YY1基因在整体上均为雌性高表达但两性中差异不显著，基本呈现与miR-2954表达趋势相反的规律。
　　5.运用定量PCR与western blot方法检测了miR-2954超表达与抑制后YY1的表达，结果表明在mRNA水平及蛋白水平miR-2954均下调YY1的表达。

目录

论文说明

声明

摘要

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 文献综述

1．2．1 鸡的性别决定理论

1．2．2 鸡性别决定中性连锁基因的研究

1．2．3 miRNAs的相关研究

1．3 目的与意义

2 试验材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 样品

2．1．2 细胞系和质粒

2．2 主要仪器、试剂和溶液配制

2．2．1 主要仪器与设备

2．2．2 主要试剂和试剂盒

2．2．3 溶液配制

2．2．4 生物信息学分析相关的软件和数据库

2．3 试验方法

2．3．1 鸡胚样品采集及处理

2．3．2 总RNA提取

2．3．3 时间表达谱分析

2．3．4 双荧光素酶报告系统验证靶位点

2．3．5 靶基因YY1时间表达谱及E10．5组织表达分析

2．3．6 miR-2954的超表达与抑制

3 结果与分析

3．1 总RNA的提取及检测

3．2 miRNAs的时间表达谱分析

3．2．1 雄性显著高表达的miRNAs

3．2．2 雄性高表达但性别差异不显著的miRNAs

3．2．3 雌性高表达miRNAs

3．2．5 miR-2954的组织表达谱

3．3 靶基因的选择

3．3．1 靶基因预测及功能分析

3．3．2 候选靶基因YY1和FOXD1的分析

3．4 双荧光素酶报告系统验证靶位点

3．4．1 靶基因YY1与FOXD1的3’UTR扩增

3．4．2 T1-靶基因3’UTR重组载体构建及鉴定

3．4．3 psiCHECKTM2-靶基因3’UTR重组载体构建及鉴定

3．4．4 双荧光素酶报告系统检测

3．5 YY1在鸡胚中的时间表达谱及E10．5组织表达谱结果

3．6 miR-2954超表达与抑制

4 讨论

4．1 Z染色体miRNAs在早期鸡胚及性腺中的表达

4．1．1 Z染色体miRNAs的整体表达

4．1．2 miR-2954的表达

4．2 miR-2954与靶基因之间的调控关系

4．2．1 miR-2954的靶基因预测

4．2．2 miR-2954与YY1基因的调控关系

4．2．3 miR-2954与FOXD1基因的调控关系

5 小结

5．1 本研究所取得的结果

5．2 本研究的创新点和特色

5．3 下一步需要研究的问题

参考文献

致谢