黄颡鱼C8α、C8β和C9基因的分子克隆与表达分析

摘要

补体系统由一系列血清蛋白和细胞表面受体组成，其在非特异性免疫和特异性免疫之间起着衔接作用，而非特异性免疫和特异性免疫是机体抵御病原入侵和感染的重要防御体系。补体系统可通过经典途径、凝集素途径和旁路途径这3条既相对独立又相互作用的途径激活而发挥作用。黄颡鱼是一种重要的淡水经济鱼类，近些年来，黄颡鱼大面积和高密度养殖逐渐增多，导致黄颡鱼腹水病、体表溃疡病和红头病等病害频发，进而减少黄颡鱼的产量，影响其经济价值。因此，研究黄颡鱼补体相关基因Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9的分子特征及其在免疫过程中的表达变化，探讨其在非特异性免疫中的潜在功能，对于黄颡鱼的病害防治具有重要意义，同时可为黄颡鱼抗病品种的选育提供基础数据。
　　本研究采用RACE克隆了黄颡鱼补体相关基因Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9的部分cDNA序列，通过荧光定量PCR(qPCR)检测了Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9基因在黄颡鱼成鱼各个组织中的表达、在胚胎和早期发育时期的表达量变化以及灭活嗜水气单胞菌免疫前后Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9基因在脾、中肾、头肾、肝和血液五种免疫组织中的表达量变化。主要研究结果如下:
　　1.黄颡鱼Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9基因cDNA部分序列的克隆与序列分析
　　黄颡鱼Pf_C8α cDNA部分序列长1939bp（GenBank登录号KT588317），包括145bp的3'-UTR和1794 bp的编码区，编码597个氨基酸。同源性比对显示，黄颡鱼Pf_C8α氨基酸序列与斑马鱼（Danio rerio）、鳜（Siniperca chuatsi）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）的同源性较高，分别为54％、52％和51％。
　　黄颡鱼Pf_C8β cDNA部分序列长1767 bp（GenBank登录号KT588318），包括31bp的5'-UTR、35 bp的3'-UTR和1701 bp的编码区，编码566个氨基酸。同源性比对显示，黄颡鱼Pf_C8β氨基酸序列与斑马鱼、白斑狗鱼(Esox lucius)和虹鳟的同源性分别为62％、61％和60％。
　　黄颡鱼Pf_C9 cDNA部分序列长1939 bp（GenBank登录号KT454382），包括133bp的3'-UTR和1806 bp的编码区，编码601个氨基酸。同源性比对显示，黄颡鱼Pf_C9氨基酸序列与草鱼（Ctenopharyngodon idella）、虹鳟和条石鲷（Oplegnathusfasciatus）的同源性分别为52％、50％和49％。与其他硬骨鱼类的C8α、 C8β和C9氨基酸序列相似，黄颡鱼Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9氨基酸序列都含有4个不同的功能结构域，分别为TSP1、LDLR-A、MACPF和EGF结构域。
　　2.黄颡鱼Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9 mRNA的组织表达
　　qPCR结果表明，黄颡鱼补体基因Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9 mRNA在检测的各个组织中均有表达，且在肝脏中的表达量最高，在头肾、前肠、中肠、后肠、中肾、心脏和脾组织中表达量中等，在其他组织中表达量较低。
　　3.黄颡鱼Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9 mRNA在胚胎和早期发育时期的表达
　　黄颡鱼Pf_C8α mRNA在胚胎和早期发育各个阶段均有表达，从受精卵至神经胚期表达水平较低，发育至心跳期呈现最高表达水平，从血液循环期至刚孵出仔鱼，Pf_C8α mRNA表达量显著下降至中等水平;孵出后，仔鱼中Pf_C8α mRNA表达量下降至较低水平。
　　黄颡鱼Pf_C8β mRNA在胚胎和早期发育各个阶段均有表达，在受精卵中呈现中等表达，从卵裂期至心跳期，Pf_C8β mNA表达量显著下降至较低水平，在血液循环期表达量上调至中等水平，在刚孵出仔鱼中呈现最高表达水平;孵出后5d，Pf_C8β mRNA表达量显著下降到较低水平，孵出后15 d～25 d，Pf_C8β mRNA表达量又小幅升高至中等水平。
　　黄颡鱼Pf_C9 mRNA在胚胎和早期发育各个阶段均有表达，从受精卵至囊胚期表达水平很低，在原肠胚期升高至中等表达水平，在刚孵出仔鱼中呈现最高表达水平;孵出后1 d～25 d，Pf_C9 mRNA表达量显著下降至中等水平，孵出后30 d表达量逐渐降低至较低水平。
　　4.嗜水气单胞菌免疫后黄颡鱼Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9 mRNA表达量的变化
　　注射灭活嗜水气单胞菌后，黄颡鱼Pf_C8α mRNA表达量在检测的脾、中肾、头肾、肝和血液五种组织中都出现显著上调。在中肾和脾中，黄颡鱼Pf_C8α mRNA在注射免疫后12 h出现最高表达。在肝脏中，Pf_C8α mRNA表达量在注射免疫后72 h达到峰值。在头肾中，Pf_C8α mRNA表达量在注射免疫后12h显著上调并在24 h达到峰值。在血液中，Pf_C8α mRNA表达量在注射免疫后72 h～168 h显著升高并在168 h达到最高值。
　　注射灭活嗜水气单胞菌后，黄颡鱼Pf_C8β mRNA表达量在检测的脾、中肾、头肾、肝和血液五种组织中都出现显著上调。在血液、中肾和脾中，黄颡鱼Pf_C8βmRNA表达量在注射免疫后120 h出现显著上调，并在168 h达到峰值。在肝脏中，Pf_C8β mRNA表达量在注射免疫后120 h达到峰值。在头肾中，Pf_C8β mRNA表达量在注射免疫后24 h达到峰值。
　　注射灭活嗜水气单胞菌后，黄颡鱼Pf_C9 mRNA表达量在检测的脾、中肾、头肾、肝和血液五种组织中都出现显著上调。在中肾和脾中，黄颡鱼Pf_C9 mRNA在注射免疫后12h出现最高表达。在肝脏中，Pf_C9 mRNA表达量在注射免疫后48 h达到峰值。在头肾中，Pf_C9 mRNA表达量在注射免疫后12h显著上调并在24 h达到峰值。在血液中，Pf_C9 mRNA表达量在注射免疫后72 h～168 h显著升高并在168 h达到最大值。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1 鱼类补体系统的研究进展

1．1 鱼类补体系统的激活途径

1．2 鱼类补体系统的组成成分

1．3 鱼类补体系统的功能

2 黄颡鱼研究概况

2．1 黄颡鱼的生物学习性

2．2 黄颡鱼的苗种繁育与生长

2．3 黄颡鱼的主要病害及免疫学

3 本研究的目的和意义

第二章 黄颡鱼Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9基因的克隆与序列分析

1 材料与方法

1．1 实验鱼样本

1．2 主要实验仪器

1．3 药品与试剂

1．4 引物设计

1．5 实验方法

2 结果与分析

2．1 总RNA的提取

2．2 黄颡鱼Pf_C8α基因cDNA部分序列的克隆与序列分析

2．3 黄颡鱼Pf_C8β基因cDNA部分序列的克隆与序列分析

2．4 黄颡鱼Pf_C9基因cDNA部分序列的克隆与序列分析

3 讨论

第三章 黄颡鱼Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9基因的表达分析

1 材料和方法

1．1 实验内容及样本采集

1．2 主要实验仪器

1．3 主要药品与试剂

1．4 引物设计

1．5 实验方法

2 结果与分析

2．1 黄颡鱼Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9 mRNA的组织表达

2．2 黄颡鱼Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9 mRNA在胚胎和早期发育时期的表达

2．3 嗜水气单胞菌免疫后黄颡鱼Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9 mRNA表达的变化

3 讨论

3．1 黄颡鱼Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9 mRNA的组织表达

3．2 黄颡鱼Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9 mRNA在胚胎和早期发育时期的表达

3．3 嗜水气单胞菌免疫后黄颡鱼Pf_C8α、Pf_C8β和Pf_C9 mRNA表达的变化

参考文献

攻读学位期间发表论文情况

致谢