应用猪口腔液拭子监控伪狂犬病病毒感染

摘要

口腔液诊断疾病方法是一种通过检测机体口腔液中病原或特异性抗体来诊断疾病的一种技术。在20世纪80年代中期，研究人员利用口腔液检测到艾滋病毒（HIV），随后该技术得到了迅速的发展，并扩展到猪病诊断领域。到目前为止，应用猪口腔液可以检测的病原有非洲猪瘟病毒（ASFV）、经典猪瘟病毒（CSFV）和猪圆环病毒2型（PCV2）等病毒，但是未见用于检测伪狂犬病病毒的报道。
　　伪狂犬病（Pseudorabies，PR或Aujeszky’s disease，AD）是一种由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染引起的多种家畜和野生动物共患的急性、热性传染病，严重危害我国养猪业的发展。目前对猪群 PRV感染的监控都是通过活体采集扁桃体或血液分离血清，操作费时费力，且对动物应激较大。为此，本研究尝试建立通过采集和检测口腔液中伪狂犬病病毒的方法，并与传统采样方法相比较，为临床监控该病毒提供便利方法。主要研究内容如下：
　　1.口腔液收集材料的选择
　　用不同材质和规格的绳子供猪啃咬，在 DMEM培养基中分别浸泡5~30min，结果显示棉绳经受猪啃咬的时间最长，直径为1.0cm的棉绳在吸附20~30min后，吸附DMEM量最大。
　　2．棉绳吸附病毒能力评估和检测方法的建立
　　灭菌棉绳分别放入经过10倍梯度稀释的PRV液中，吸附30min，提取各梯度的病毒液和棉绳吸附液中 PRV DNA，并分别经常规 PCR方法和荧光定量 PCR方法检测，同时将病毒液和棉绳吸附液冷藏（4~8℃）0~24 h后，提取DNA进行常规 PCR方法检测。结果显示，病毒液与棉绳吸附液经常规 PCR方法能检测出最小病毒量分别为102TCID50/0.1mL和103TCID50/0.1mL；荧光定量 PCR方法能检测出各梯度病毒液和棉绳吸附液中最小检出量每微升病毒 DNA相对拷贝数分别为：8.113、7.034、6.380、5.410、4.250、4.039、3.529、2.877和7.739、6.759、6.021、5.224、3.793、3.729、3.284、2.763；冷藏0h、6h、12h、18h和24 h后，病毒液与棉绳吸附液能检测出最小病毒量分别为102TCID50/0.1mL和103TCID50/0.1mL。结果表明，棉绳吸附液中检出的病原含量略低于病毒液，病毒液与棉绳吸附液在冷藏24 h内，不影响检测敏感性。
　　3.人工感染仔猪口腔液中PRV的检测
　　将 PRV gB抗体阴性仔猪分别接种 PRV-HNX或 DMEM，随后用常规 PCR方法分别检测每天采集的口腔液拭子样品，用荧光定量 PCR方法分别检测每天采集的口腔液拭子和鼻拭子样品，同时检测1~14d，21d，28d血清中 gB和 gE抗体。结果显示，常规 PCR方法和荧光定量 PCR方法都能在 PRV-HNX株接种后1~28d采集的口腔液拭子样品中检测PRV存在，而接种DMEM的仔猪的口腔液拭子样品中均未检测出PRV；仔猪感染PRV-HNX株后1~28d，其口腔液拭子比鼻拭子样品会有更高的PRV基因组拷贝数；PRV gB抗体阴性仔猪接种 PRV-HNX株7d后，仔猪血清中PRV gB和gE抗体都转阳。结果表明，本研究建立的PCR方法能监控PRV感染后在仔猪的口腔液中排毒，且口腔液拭子中 PRV的病毒含量高于鼻拭子，猪群感染PRV后，口腔液中排毒时间早于血清中抗体转阳时间。
　　4.临床应用
　　从8个规模化猪场采集的148份猪口腔液拭子中，检出PRV阳性80份，阳性率为54.05％，而对应猪的血清中 PRV gB和 gE抗体阳性率分别为88.51%和45.95%，口腔液中PRV病原检出率与血清中PRV gB和PRV gE抗体符合率分别为61.07%和85.01%。
　　综上所述，本研究建立了猪口腔液拭子中 PRV的检测方法，口腔液拭子比鼻拭子更适于PRV检测，比血清学抗体检测方法更早地监控 PRV感染，为监控伪狂犬病病毒在猪群感染提供了新的方法。

目录

声明

缩略语表(Abbreviation)

1前言

1.1伪狂犬病概况

1.2口腔液

1.3口腔液检测的优势

1.4口腔液的应用

2.研究目的和意义

3材料与方法

3.1材料

3.2方法

3.3试验设计

4结果与分析

4.1不同材质比较结果

4.2最佳采样时间和方法

4.3伪狂犬病病毒不同靶基因扩增效率的比较结果

4.4棉绳吸附PRV液的灵敏性检测结果

4.5人工感染排毒监测结果

4.6临床监控

5讨论

5.1口腔液的应用及意义

5.2选材和采样时间

5.3人工模拟应用猪口腔液监控PRV感染状况

5.4人工感染监控与临床检测

5.5用口腔液检测猪病原的前景

6结论

参考文献

致谢