L-抗坏血酸对小鼠卵母细胞和胚胎发育的作用及其机制研究

摘要

获取高质量成熟的卵母细胞和胚胎是进行人工辅助生殖和动物生产的关键。相对于体内自然发育的条件，体外培养条件会导致卵母细胞和胚胎在成熟和发育过程中出现异常的表观遗传修饰，从而会导致卵母细胞和胚胎发育率以及发育质量的下降，严重的甚至会引起卵母细胞和胚胎的死亡;维生素C是人类必需的营养物质，最近的研究发现它能广泛地影响表观遗传修饰，并且可以提高胚胎的发育率。然而，维生素C在卵母细胞减数分裂成熟过程中的作用及其影响胚胎发育的机理仍有待研究。例如:维生素C能否影响小鼠卵母细胞的发育率、提高小鼠卵母细胞和胚胎的发育质量、改善因体外培养条件而带来的异常的表观遗传修饰等。
　　本实验利用卵母细胞和胚胎体外细胞培养、细胞免疫荧光、Western blot、实时荧光定量PCR等技术，检测了维生素C对于小鼠卵母细胞和胚胎体外培养发育的影响，探讨了L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞和胚胎体外培养最佳的处理浓度。主要实验结果如下:
　　1.不同浓度的L-Ascorbic acid处理小鼠卵母细胞后，导致GVBD率都出现了下降;50ug/ml处理组显著提高了第一极体排放率;100ug/ml处理组显著降低了第一极体排放率;200ug/ml和1000ug/ml显著降低了GVBD率;
　　2.免疫荧光结果显示:100ug/mlL-Ascorbic acid处理卵母细胞，导致了染色体排列出现异常，排列较为松散;200ug/ml和1000ug/mlL-Ascorbic acid处理卵母细胞后，染色体排列出现了明显的异常，纺锤体组装也出现了异常;
　　3.不同浓度的L-Ascorbic acid处理小鼠卵母细胞后，各个处理组甲基化蛋白DNMT1表达量均出现上升;100ug/ml处理浓度开始差异性显著;小鼠卵母细胞5-mc免疫荧光结果图显示，200ug/ml和1000ug/ml处理均能显著提高卵母细胞5-mc水平;
　　4.体内成熟卵母细胞纺锤体检验点蛋白BubR1低于体外培养的小鼠卵母细胞;50 ug/ml处理显著性的降低体外培养卵母细胞BubR1蛋白的表达量，接近于体内BubR1蛋白的表达量;100 ug/ml处理组和1000ug/ml处理组著地降低了体外培养卵母细胞纺锤体检验点相关蛋白BubR1蛋白的表达量;
　　5.不同浓度的L-Ascorbic acid处理对体外培养卵母细胞通路蛋白P-ERK表达量的影响:50ug/mlL-Ascorbic acid处理组降低了P-ERK表达量;100ug/ml处理浓度开始，P-ERK蛋白的表达量显著的上升;
　　6.RT-PCR结果显示小鼠卵母细胞中主要起作用的去甲基化基因是TET3，不同浓度的L-Ascorbic acid处理小鼠卵母细胞后，甲基化基因DNMT1和去甲基化基因TET3的mRNA水平均上升;全能性基因Kif4的mRNA水平均下降;100ug/ml处理后OCT4mRNA水平高于对照组，但差异性不显著;其他处理组mRNA水平均下降;
　　7.2cell时期体内胚胎5-mc水平高于体外培养胚胎，5-hmc水平体内胚胎显著高于体外培养胚胎;8cell、Morula、Blastula时期体外培养胚胎5-mc水平显著高于体内胚胎;8cell、Blastula时期体外培养胚胎5-hmc水平显著高于体内胚胎，Morula时期体外培养胚胎5-hmc水平高于体内胚胎，差异不显著;
　　8.Morula时期，体内胚胎去甲基化基因TET2 mRNA水平要显著高于体外培养胚胎; TET3主要在2cell时期起作用，体内胚胎TET3 mRNA的水平显著高于体外培养胚胎;
　　9.50ug/ml浓度L-Ascorbic acid可以显著提高2cell、8cell; Morula、Blastula时期的胚胎发育率。

目录

声明

摘要

缩略词表(Abbreviation)

1 前言

1．1 表观遗传调控概述

1．1．1 DNA甲基化和去甲基化

1．1．2 组蛋白乙酰化

1．1．3 X染色体失活

1．2 小鼠卵母细胞减数分裂概述

1．2．1 小鼠卵母细胞减数分裂

1．2．2 调控卵母细胞减数分裂的蛋白因子

1．3 维生素C的研究概况

1．3．1 维生素C的简介

1．3．2 维生素C的生理功能

1．3．3 维生素C与表观遗传调控的研究进展

1．3．4 维生素C应用前景与展望

1．4 研究的目的与意义

2 材料和方法

2．1 实验技术路线图

2．2 实验材料

2．2．1 实验动物

2．2．2 主要仪器设备

2．2．3 实验试剂药品

2．2．4 主要试剂配制

2．2．5 RT-PCR引物

2．3 试验方法

2．3．1 小鼠卵母细胞收集及培养

2．3．2 小鼠胚胎获取与培养

2．3．3 小鼠卵母细胞和胚胎5-mc、5-hmc免疫荧光

2．3．4 卵母细胞总cDNA的获取

2．3．5 RT-PCR检测

2．3．6 WB检测卵母细胞相关蛋白表达

2．4 数据统计

3 结果与分析

3．1 L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞体外发育的影响

3．2 L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞染色体动态和微管蛋白的影响

3．3 L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞DNA甲基化水平的影响

3．3．1 L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞DNA甲基化相关蛋白的影响

3．3．2 L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞5-mc免疫荧光检测

3．4 L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞纺锤体检验点相关蛋白的影响

3．5 L-Aseorbic acid对小鼠卵母细胞信号通路相关蛋白P-ERK的影响

3．6 RT-PCR检测L-Ascorbic acid处理小鼠卵母细胞相关基因mRNA水平表达

3．6．1 去甲基化相关基因TET家族和DNMT1mRNA水平表达

3．6．2 L-Ascorbic acid处理小鼠卵母细全能性基因mRNA水平表达

3．7 体内胚胎和体外胚胎5-mc和5-hmc差异性比较

3．7．1 体外培养胚胎和体内胚胎5-mc差异性比较

3．7．2 体外培养胚胎和体内胚胎5-hmc差异性比较

3．8 RT-PCR检测胚胎去甲基化基因mRNA的表达

3．9 L-Ascorbic acid对小鼠胚胎发育率的影响

4 讨论

4．1 L-Ascorbic Acid影响小鼠卵母细胞体外发育相关机理的探讨

4．1．1 体外培养条件对卵母细胞发育成熟的影响

4．1．2 L-Ascorbic Acid对小鼠卵母细胞发育率、染色体及纺锤体动态的影响

4．1．3 L-Ascorbic Acid对小鼠卵母细胞DNA甲基化影响机理的探讨

4．1．4 L-Ascorbic Acid对小鼠卵母细胞纺锤体检验点和信号通路机理影响的探讨

4．1．5 小结

4．2 L-Ascorbic Acid影响小鼠胚胎体外发育相关机理的探讨

5 小结

5．1 主要结论

5．2 本研究的创新点

5．3 需要进一步研究的相关问题

参考文献

致谢