土壤矿物介导下细菌生物膜形成过程及机制

摘要

生物膜作为细菌存在于自然界生物体或非生物体表面的重要形态，其在医学、工业以及农业上的影响和作用受到广泛的重视。作为地球上最普遍的一种生命形式，生物膜可通过形成的胞外聚合物(EPS)使微生物获得竞争性优势，如加强了生物膜内微生物之间群体感应效应、帮助细胞在表面定殖和互养共生、保护细胞防止被捕食、抵抗干旱、减少污染物对细胞的毒性等。土壤中微米和纳米级矿物由于比表面积大、电荷密度高，表面富含离子、水分及其它营养物质，常与微生物结合在一起，在土壤生物地球化学界面的形成、结构调控、活性和功能发挥等方面具有重要的作用。然而，到目前为止，从生物膜角度研究细菌与土壤矿物相互作用还比较少见。
　　本文以土壤中常见的矿物和微生物为供试材料，借助激光共聚焦显微镜(CLSM)、原子力显微镜(AFM)、衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)和q-PCR等现代仪器分析技术，研究了土著细菌游离态细胞与生物膜细胞表面性质的差异，以及土壤典型矿物对细菌生物膜形成的影响，获得如下主要结果:
　　(1)明晰了土著细菌游离态细胞与生物膜细胞之间的表面性质差异。恶臭假单胞菌成膜速度快，生物膜周期为24h，而枯草芽孢杆菌的生物膜周期为72h;细菌在形成生物膜后，细胞的尺寸变小、细胞形状由杆状变为椭球形，细胞的疏水性增强，表面带电量增多、电负性增强;与游离态细胞相比，生物膜细胞表面官能团的种类不发生改变，但是表面官能团的浓度会增加。
　　(2)探明了土壤中典型的粘土矿物（蒙脱石和高岭石）以及铁氧化物（针铁矿）对土壤中常见的细菌（枯草芽孢杆菌）生物膜形成的影响机制。实验结果表明，在针铁矿体系中，生物膜在48h时生物量达到最大值，而蒙脱石和高岭石体系中生物膜生物量在60 h达到最大。激光共聚焦显微镜观察到48h时针铁矿体系中形成了致密、具有多层细胞的生物膜。细菌与矿物作用4h后，针铁矿体系中细胞失活率高达60％，其次是高岭石和蒙脱石。原子力显微镜结果显示细菌与针铁矿之间发生紧密吸附，针状的针铁矿可以刺破细胞壁，细胞感应到不利环境，通过调控枯草芽孢杆菌生物膜形成的两个主要基因abrB和sinR，使细胞倾向于向气液表面运动并聚集形成生物膜。矿物的理化性质是矿物影响细菌形成生物膜的主导因素。
　　(3)明确了不同浓度的典型土壤金属氧化物（针铁矿、勃母石和水钠锰矿）对恶臭假单胞菌生长及生物膜形成的影响机制。当针铁矿浓度为1～100mg L-1时，可以促进恶臭假单胞菌的生长和生物膜的形成，而针铁矿浓度为100～500mg L-1时，会抑制细菌的生长和生物膜的形成;当勃姆石浓度低于20mg L-1时可促进细菌的生长和生物膜的形成，20～500mg L-1勃姆石会抑制恶臭假单胞菌的生长和生物膜的形成;不同浓度的水钠锰矿对恶臭假单胞菌的生长没有影响，但是会抑制细菌生物膜的形成。原子力显微镜图像显示，针铁矿表面细菌的细胞膜被刺破，细胞完整性受损;勃姆石表面细胞发生了溶解;水钠锰矿表面细胞粒径变小、表面褶皱增加。不同土壤金属氧化物与细菌相互作用的强度和沉降能力是影响恶臭假单胞菌生物膜形成的关键因素。生物膜中的EPS可以显著的提高恶臭假单胞菌对矿物的耐受能力。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 生物膜

1．1．1 生物膜的定义

1．1．2 生物膜的组成

1．1．3 生物膜的形成过程

1．1．4 生物膜内部异质性特征

1．1．5 生物膜的功能

1．2 生物膜培养的主要方法

1．2．1 微孔板法

1．2．2 平板法

1．2．3 置片法

1．2．4 流室法(Flow cell)

1．3 生物膜主要的检测方法

1．3．1 染色法

1．3．2 激光共聚焦显微镜

1．3．3 原子力显微镜

1．3．4 傅里叶变换红外光谱

1．3．5 其他技术

1．4 影响生物膜形成的因素

1．4．1 养分因素

1．4．2 温度、氧气、渗透压

1．4．3 群体感应

1．5 土壤中的生物膜

1．6 论文研究目的和内容

第二章 细菌生物膜细胞和游离态细胞的形态及性质差异

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验菌株

2．2．2 生物膜细胞的生长曲线

2．2．3 生物膜细胞的收集

2．2．4 原子力显微镜(AFM)原位观察

2．2．5 扫描电子显微镜

2．2．7 Zeta电位和粒径的测定

2．2．8 疏水性的测定

2．2．9 细胞等电点的测定

2．2．10 自动电位滴定

2．3 结果与讨论

2．3．1 细菌生物膜生长曲线

2．3．2 细胞形貌

2．3．3 细菌表面疏水性和电荷性质

2．3．4 ATR-FTIR

2．3．5 电位滴定

2．4 结论

第三章 土壤矿物对枯草芽孢杆菌生物膜形成的影响及机制

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验菌株

3．2．2 土壤矿物

3．2．3 微孔法培养生物膜

3．2．4 激光共聚焦显微镜观察(CLSM)

3．2．5 衰减全反射傅里叶红外光谱分析(ATR-FTIR)

3．2．6 生物膜内组分的测定

3．2．7 细菌在矿物表面的存活

3．2．8 细菌在矿物悬液中的存活

3．2．9 死细胞对生物膜形成的影响

3．2．10 原子力显微镜(AFM)观察生物膜在矿物表面上的形成

3．2．11 实时荧光聚合酶链反应(qRT-PCR)

3．3 结果与讨论

3．3．1 蒙脱石、高岭石、针铁矿对枯草芽孢杆菌生物膜的不同影响

3．3．2 不同矿物对生物膜结构的影响

3．3．3 不同矿物影响生物膜的机制

3．3．6 细胞对矿物的响应

3．3．7 生物膜形成过程中基因的调控

3．3．8 枯草芽孢杆菌在矿物悬液中形成生物膜的模型

3．5 结论

第四章 土壤金属氧化物对恶臭假单胞菌生长和生物膜形成的影响

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验菌株

4．2．2 实验矿物

4．2．3 粒径测定

4．2．4 细菌在矿物悬液中生长和生物膜的形成

4．2．5 CLSM

4．2．6 AFM

4．2．7 沉降实验

4．2．8 死细胞存在下生物膜的形成

4．2．9 含／无可溶性EPS条件下矿物对生物膜的影响

4．3 结果与讨论

4．3．1 不同金属氧化物对细菌生长和生物膜形成的影响

4．3．2 恶臭假单胞菌(P．putida KT2440)在矿物表面的吸附和存活

4．3．3 死细胞促进细胞生长和生物膜的形成

4．3．4 细菌与矿物共沉淀

4．3．5 EPS在成熟生物膜中的作用

4．4 结论

第五章 研究结论、创新点和展望

5．1 研究结论

5．2 创新点

5．3 研究展望

参考文献

攻读博士学位期间撰写的论文

致谢