甘蓝型油菜种子含油量遗传及油脂合成相关基因功能分析

摘要

甘蓝型油菜是世界重要的油料作物之一，在我国其种植面积和总产量均占全球的1/4，居世界首位。高油育种是油菜育种的主要目标之一，提高油菜种子含油量是提高单位面积产油量的关键措施之一。种子含油量是甘蓝型油菜品质特征的重要指标，深入解析种子含油量的遗传基础，将会很大程度上加快高油育种进程。运用完全双列杂交与正反回交设计，全面估算并量化控制甘蓝型油菜种子含油量的母体效应、胚基因效应、花粉直感与细胞质效应等遗传因素。期望通过对甘蓝型油菜种子含油量遗传规律的深入解析，为育种家更加高效快速培育高油新品种打下坚实基础。
　　本研究运用种子含油量不同的甘蓝型油菜品种和高世代纯合自交系，按9×9完全双列杂交设计分析种子含油量的遗传效应及基因与环境互作效应。 GoCGm分析结果显示甘蓝型油菜种子含油量主要由遗传效应(VG)和基因与环境互作效应(VGE)共同控制，且二者共占总表型变异的86.19％。因为基因与环境互作效应占总遗传变异的51.68％，在油菜高油育种中基因型与环境互作效应不容忽视。母体效应占总遗传效应的75.03％，胚基因效应和细胞质效应则分别为21.02％和3.95％。F1种子含油量主要由母体效应控制，同时存在较小的花粉直感。配合力方差分析表明，油菜种子含油量的一般配合力和特殊配合力方差均达显著水平，表明加性效应与非加性效应对于该性状而言十分重要。同时，母体效应方差达显著水平而非母体效应则不显著，表明该性状并非严格的受核基因控制，可能同时存在细胞质效应。甘蓝型油菜种子含油量主要由母体效应、胚基因效应、花粉直感、细胞质效应以及相应基因与环境互作效应共同控制。9个亲本中仅高油亲本H1的各遗传成分均为正向，因此该油菜品系在高油育种中更适合做亲本，又因为该品系不存在不良胞质效应亦可做母本。油菜高油育种过程中，亲本的选择特别是母本的选择尤为重要，而提供花粉的父本与来自母本的细胞质效应和胚基因效应均需要关注。
　　为从转录水平阐明调控油菜种子油脂合成的分子机制，本研究运用甘蓝型油菜cDNA芯片差异表达基因分析尝试获得可能参与调控种子油脂合成的基因。 cDNA芯片分析结果显示，BnCIPK9在高油单株低表达，然而在低油单株高表达，即该基因可能负调控油菜种子含油量。gDNA测序分析结果显示BnCIPK9基因存在4个拷贝，且氨基酸序列相对比较保守。qRT-PCR分析表明该基因在高油亲本P1的茎、叶片和24DAP角果皮中均高表达，而在花、蕾、24DAP种子中低表达，成熟根部组织中表达水平最低。在胚珠不同发育时期其转录水平不相同，且种子发育中期转录水平相对较高。 BnCIPK9启动子GUS活性分析与qRT-PCR结果基本一致，且BnCIPK9的表达模式与拟南芥AtCIPK9类似在光合组织和非光合组织中均普遍表达。从亲本gDNA中分别克隆BnCIPK9不同拷贝的5'非翻译区，并分别命名为BnCIPK9启动子1(3050bp)和BnCIPK9启动子2(3372bp)，该启动子区域包含多个顺式调控元件。分析结果显示BnCIPK9基因的两个拷贝的启动子区均包含两个糖抑制顺式调控元件(TATCCA)，水稻的α-淀粉酶3基因启动子区最先发现该调控元件。同时，BnCIPK9启动子1和BnCIPK9启动子2分别包含4和6个I-BOX元件。BnCIPK9启动子1和启动子2上则分别含有4和5个E-BOX，该调控元件主要与种子特异性表达有关。甘蓝型油菜种子特异过表达该基因的转基因株系表型分析显示，T2代种子含油量显著低于非转基因对照。即BnCIPK9可能参与调控种子油脂合成，且为负调控因子。
　　GC分析结果表明，拟南芥cipk9突变体种子含油量为26.25％，而野生型则为24.06％。cipk9突变体种子脂肪酸成分分析结果显示，cipk9突变体种子C20∶1Δ11的相对比例显著高于野生型，而C18∶2的相对比例则显著低于野生型。互补转基因株系种子含油量与野生型之间不存在差异，同时过表达转基因拟南芥株系种子含油量低于cipk9，表明AtCIPK9可能负调控种子油脂合成。cipk9突变体在无糖培养基上，虽可正常萌发但其幼苗建成严重受抑制，外源添加蔗糖或者葡萄糖亦可恢复该表型。互补转基因株系与过表达转基因株系均可恢复纯合突变体该缺陷表型。CBL2和CBL3是CIPK9上游与之互作的蛋白，仅cbl3突变体与cipk9表型一致，无糖条件下cbl3突变体虽可萌发但幼苗建成受抑制，但是还需做进一步验证。外界环境中糖缺乏时，AtCBL3可能与AtCIPK9一起在幼苗建成过程中发挥调控作用。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 文献综述

1．1 种子性状遗传研究进展

1．1．1 种子性状遗传效应

1．1．2 种子性状遗传分析模型发展

1．2 油脂研究进展

1．2．1 种子含油量遗传研究进展

1．2．2 植物种子TAG生物合成

1．3 CIPKs

1．3．1 CIPK结构特征

1．3．2 CBL-CIPK

1．4 拟南芥的CIPK研究进展

1．4．1 CIPK与离子胁迫

1．4．2 CIPK对ATP酶活性调节

1．4．3 CIPK与ABA信号路径

1．4．4 CIPK与糖信号

1．4．5 CIPK与其他信号

1．5 酵母SNF1与TAG合成

1．6 本研究目的与意义

2．1 前言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验设计及性状考察

2．2．3 统计分析方法

2．3 结果与分析

2．3．1 种子含油量

2．3．2 油菜种子含油量方差

2．3．3 甘蓝型油菜种子含油量配合力

2．3．4 油菜含油量的母体效应与花粉直感

2．3．5 油菜种子含油量细胞质效应

2．3．6 甘蓝型油菜种子含油量的遗传效应

2．3．7 亲本遗传成分的估算

2．4 讨论

2．4．1 甘蓝型油菜种子含油量的遗传规律

2．4．2 环境对种子含油量的影晌

2．4．3 高油育种

2．4．4 配合力分析与亲本的选配

第三章 甘蓝型油菜种子含油量相关基因克隆和功能分析

3．1 材料与方法

3．1．1 植物材料

3．1．2 质粒载体和菌株

3．2 实验方法

3．2．1 cDNA芯片

3．2．2 候选基因的克隆

3．2．3 转化载体构建

3．2．4 植物的遗传转化

3．2．5 植物总RNA抽提

3．2．6 基因表达分析

3．2．7 GUS染色分析

3．2．8 气相色谱内标法测量拟南芥种子含油量(GC)

3．2．9 甘蓝型油菜种子含油量测定

3．2．10 甘蓝型油菜成熟种子透射电镜观察

3．3 结果与分析

3．3．1 候选基因

3．3．2 候选基因序列分析

3．3．3 基因表达分析

3．3．4 启动子

3．3．5 甘蓝型油菜过表达转基因株系获得与表型鉴定

3．3．6 AtCIPK9基因启动子分析

3．3．7 AtCIPK9基因功能

3．3．8 AtCIPK9过表达转基因株系获得及表型鉴定

3．3．9 AtCIPK9上游基因分析

3．4 讨论

3．4．1 AtCIPK9和BnCIPK9负调控种子含油量机理推测

3．4．2 AtCIPK9与幼苗建成

3．4．3 CIPK9和糖信号

3．4．4 AtCIPK9可能参与调控油脂与糖类相互转化

参考文献

附录

作者简介与在读期间所发表的学术论文

致谢