莲藕采后主要腐败菌的分离鉴定及空气放电对其抑菌机理的研究

摘要

空气放电主要应用在果蔬保鲜上，通过抑制微生物的生长繁殖降低果蔬的腐败率，然而对空气放电抑菌机理的研究却不甚明了。本课题对模拟冷链运输莲藕上的腐败菌进行分离纯化、鉴定并以采后莲藕上的主要腐败菌之一尖孢镰刀菌为研究对象，从菌丝、孢子的生长及其超微结构的变化、细胞表面电荷的变化、细胞壁中几丁质和壳聚糖的变化、细胞膜中脂肪酸的变化、降解植物细胞壁酶活性变化等方面来研究空气放电对尖孢镰刀菌的抑菌机理。主要研究结果如下:
　　(1)对模拟冷链运输上的采后莲藕腐败菌进行分离纯化，结合形态学和分子生物学鉴定，确定尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和茄病镰刀菌(Fusarium solani)为采后莲藕主要腐败菌。
　　(2)空气放电对尖孢镰刀菌孢子萌发和菌丝生长都有显著的抑制作用，且抑菌效果与处理时间与呈正相关，处理时间越长，菌丝的生长速度越慢，孢子的萌发率越低;通过扫描电镜和透射电镜观察发现空气放电处理后的菌丝体干瘪褶皱且表面粗糙，外层结构不完整，对照组菌丝光滑，粗细均匀一致，无褶皱，同时空气放电处理后的菌丝细胞和孢子细胞形态不规则，细胞壁内陷或者突起，细胞壁厚薄不均匀，细胞内线粒体较对照组显著减少，出现大量液泡且液泡体积较大，细胞质失去紧致结构，对照组孢子细胞形态正常，呈椭圆形，细胞壁厚薄均匀，细胞质较为紧致;利用AO/EB荧光染料标记孢子细胞，得到空气放电处理后的孢子细胞出现凋亡，且臭氧和负离子（ozone+NAI）处理后的孢子凋亡率显著高于臭氧(ozone)和负离子(NAI)单独作用。
　　(3)利用zeta电位仪测定孢子细胞表面电势，得到孢子细胞表面电势为负值，即孢子细胞表面负电荷占优势，空气放电处理后zeta电势增加，ozone+NAI处理组孢子细胞表面的负电荷最少，其次是ozone处理和NAI处理组。结合激光共聚焦技术，将表面带正电荷的CdSe/ZnS壳核式量子点标记细胞表面电荷，未处理组孢子细胞表面负电荷标记的量子点荧光强度整体较强，表面负电荷分布均匀，空气放电处理组量子点分布不均匀，荧光强度整体较弱，局部化分布明显。
　　(4)结合分光光度法、红外分析法、X-射线衍射法、元素分析法得到，空气放电处理后细胞壁通透性增大，几丁质酶活升高，且ozone+NAI处理组显著高于ozone和NAI单独处理组;通过扫描电镜观察发现对照组几丁质分子结构紧实，呈片状或块状堆积，表面形态光滑，无明显的块状分散颗粒，空气放电处理后的几丁质分子结构松散，有大量的碎屑颗粒分子存在，对照组壳聚糖分子颗粒呈明显的块状分布，表面较为粗糙，有许多碎屑颗粒分子附着在块状颗粒表面，空气放电处理后的壳聚糖分子颗粒更为分散，无大型块状颗粒分子存在，表面更加粗糙;红外分析后发现空气放电对几丁质和壳聚糖官能团位置无显著影响，但增加了壳聚糖的脱乙酰度;空气放电处理后几丁质的结晶度较未处理组显著增高，壳聚糖的结晶度降低;几丁质和壳聚糖的C/N比率降低，其中ozone+NAI处理组C/N比率最小，其次为NAI和ozone单独处理组，未处理组C/N比率显著高于处理组。
　　(5)采用分光光度法得到空气放电显著提高了细胞膜通透性;未处理组麦角固醇含量显著高于空气放电处理组，其中ozone、NAI单独处理组麦角固醇含量显著高于ozone+NAI处理组;采用气相色谱对细胞膜脂肪酸进行分析，得到饱和脂肪酸:空气放电处理组肉豆蔻酸、十五烷酸、花生酸、山嵛酸、二十三烷酸、木蜡酸含量增加，棕榈酸、二十一烷酸含量减少; ozone处理组珍珠酸含量增加，NAI和ozone+NAI处理组珍珠酸含量减少;硬脂酸含量无显著变化。不饱和脂肪酸:空气放电处理组棕榈油酸、花生一烯酸、顺芥子酸含量增加，亚油酸含量减少，油酸含量无显著变化。空气放电处理后不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比值与未处理组相比显著降低，ozone+NAI处理组显著低于ozone、NAI单独处理组。
　　(6)空气放电对尖孢镰刀菌产生的细胞壁降解酶活性有显著的抑制效果，且ozone+NAI处理组较ozone和NAI单独处理组抑制效果更为显著。其中木聚糖酶活性与处理时间呈负相关，随着处理时间的增加酶活性逐渐降低，纤维素酶（羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、滤纸酶）和果胶酶（聚甲基半乳糖醛酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基反式消除酶、多聚半乳糖醛酸反式消除酶）活性在处理时间不超过18h时，酶活性随着处理时间的延长逐渐降低，18h后酶活性又逐渐升高，但酶活强度始终低于未处理组。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 传统抑菌方法抑菌机理研究现状

1．1．1 精油抑菌的研究现状

1．1．2 抗菌肽抑菌的研究现状

1．1．3 黄酮类化合物抑菌的研究现状

1．2 空气放电抑菌的研究现状

1．2．1 臭氧抑菌的研究现状

1．2．2 负离子抑菌的研究现状

1．2．3 臭氧和负离子协同抑菌的研究现状

1．3 细胞表面电荷的研究现状

1．3．1 细胞表面电荷与细胞凋亡的研究

1．3．2 细胞表面电荷与抗肿瘤的研究

1．4 量子点的研究现状

1．4．1 量子点的基本特性

1．4．2 量子点的应用

1．5 细胞壁和细胞膜中主要成分的介绍

1．5．1 几丁质结构的介绍

1．5．2 壳聚糖结构的介绍

1．5．3 脂肪酸的研究

1．6 本课题研究的意义、内容及创新点

1．6．1 研究意义

1．6．2 研究内容

1．6．3 创新点

1．6．4 技术路线

2 莲藕采后腐败菌的分离纯化及鉴定

2．1 材料与仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验试剂

2．1．3 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 腐败真菌的分离纯化

2．2．2 形态学鉴定

2．2．3 致病性的检测

2．2．4 分子生物学鉴定

2．3 结果与分析

2．3．1 形态学分析

2．3．2 致病性检测

2．3．3 PCR扩增

2．3．4 DNA序列分析

2．3．5 专用型引物PCR扩增

2．4 小结

3 空气放电对尖孢镰刀菌的抑菌作用

3．1 材料与仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验试剂

3．1．3 仪器设备

3．2 实验方法

3．2．1 空气放电对菌丝生长的影响

3．2．2 空气放电对孢子萌发的影响

3．2．3 菌丝超微结构的观察

3．2．4 孢子超微结构的观察

3．2．5 AO／EB荧光标记检测细胞凋亡

3．3 数据分析及处理

3．4 结果与分析

3．4．1 空气放电对尖孢镰刀菌菌丝生长的影响

3．4．2 空气放电尖孢镰刀菌孢子萌发的影响

3．4．3 空气放电对尖孢镰刀菌菌丝形态的影响

3．4．4 空气放电对尖孢镰刀菌菌丝细胞的影响

3．4．5 空气放电对尖孢镰刀菌孢子细胞的影响

3．4．6 AO／EB荧光标记检测细胞凋亡

3．4．7 空气放电对孢子细胞凋亡的影响

3．5 小结

4 量子点标记尖孢镰刀菌孢子细胞表面电荷

4．1 材料与仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验试剂

4．1．3 仪器设备

4．2 实验方法

4．2．1 孢子悬浮液的制备

4．2．2 zeta电位的测定

4．2．3 量子点标记孢子细胞表面电荷

4．3 数据分析及处理

4．4 结果与分析

4．4．1 Zeta电势变化

4．4．2 量子点标记孢子细胞表面电荷及荧光强度分析

4．4．3 zeta电势与荧光强度的关系

4．5 小结

5 空气放电对尖孢镰刀菌细胞壁的影响

5．1 材料与仪器

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验试剂

5．1．3 仪器设备

5．2 实验方法

5．2．1 空气放电对细胞壁通透性的影响

5．2．2 空气放电对几丁质酶活性的影响

5．2．3 尖孢镰刀菌中几丁质／壳聚糖的提取

5．2．4 空气放电对几丁质／壳聚糖表面形态的影响

5．2．5 空气放电对几丁质／壳聚糖影响的红外分析

5．2．6 空气放电对几丁质／壳聚糖影响的X-射线衍射分析

5．2．7 空气放电对几丁质／壳聚糖C、N元素的影响

5．3 数据分析及处理

5．4 结果与分析

5．4．1 空气放电对尖孢镰刀菌细胞壁通透性的影响

5．4．2 空气放电对几丁质酶活性的影响

5．4．3 空气放电对几丁质表面形态的影响

5．4．4 空气放电对壳聚糖表面形态的影响

5．4．5 空气放电对几丁质影响的红外分析

5．4．6 空气放电对壳聚糖影响的红外分析

5．4．7 空气放电对壳聚糖脱乙酰度的影响

5．4．8 空气放电对几丁质X-射线衍射及结晶度的影响

5．4．9 空气放电对壳聚糖X-射线衍射及结晶度的影响

5．4．10 空气放电对几丁质／壳聚糖C、N元素的影响

5．5 小结

6 空气放电对尖孢镰刀菌细胞膜的影响

6．1 材料与仪器

6．1．1 实验材料

6．1．2 实验试剂

6．1．3 仪器设备

6．2 实验方法

6．2．1 样品处理

6．2．2 空气放电对尖孢镰刀菌细胞膜通透性的影响

6．2．3 空气放电对尖孢镰刀菌麦角固醇含量的影响

6．2．4 空气放电对尖孢镰刀菌细胞膜脂肪酸的影响

6．3 数据分析及处理

6．4 实验结果与分析

6．4．1 空气放电对尖孢镰刀菌细胞膜通透性的影响

6．4．2 空气放电对尖孢镰刀菌麦角固醇含量的影响

6．4．3 空气放电对细胞膜饱和脂肪酸的影响

6．4．4 空气放电对细胞膜不饱和脂肪酸的影响

6．4．5 空气放电对不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸比值的影响

6．5 小结

7 空气放电对尖孢镰刀菌产生的细胞壁降解酶酶活的影响

7．1 材料与仪器

7．1．1 实验材料

7．1．2 实验试剂

7．1．3 仪器设备

7．2 实验方法

7．2．1 Czaper液体培养基的制备

7．2．2 细胞壁降解酶的提取

7．2．3 细胞壁降解酶活性测定

7．3 数据分析及处理

7．4 结果与分析

7．4．1 空气放电对木聚糖酶活性的影响

7．4．2 空气放电对纤维素酶活性的影响

7．4．3 空气放电对果胶酶活性的影响

7．5 小结

8 结论与展望

8．1 结论

8．2 展望

参考文献

硕士期间发表文章

致谢