木薯块根蛋白质组磷酸化对淀粉代谢的影响

摘要

木薯(Manihot esculenta Crantz)块根富含淀粉，是世界热区近8亿人的粮食作物，在我国木薯作为淀粉加工原料、生物质能源和潜在的粮食作物，其发展潜力很大。目前提高木薯块根淀粉含量仍是木薯育种家主要追求的方向，蛋白质磷酸化修饰作为一种重要的翻译后修饰对木薯块根淀粉积累的影响报道较少，研究蛋白质磷酸化修饰在不同木薯品种块根淀粉积累所存在差异，从而推测出蛋白质翻译后修饰对淀粉积累的作用，这对今后培育高淀粉木薯品种具有一定的理论依据。本文探讨了蛋白质磷酸化修饰对块根淀粉积累的影响，分别选用了高淀粉品种华南5号(M. esculenta cv. SC5, SC5)、低淀粉品种糖木薯(M. esculenta cv. CAS36-12, CAS36-12)以及淀粉含量处于中间的野生木薯近缘种(M. esculenta ssp. flabellifolia(Pohl) Ciferri, W14)作为研究对象，采获生长10个月的木薯块根，分别测定这三种材料的淀粉含量，通过Western blot和定量qRT-PCR从蛋白质和基因表达水平上揭示块根淀粉合成的机制，分析了三种木薯品种(系)块根淀粉含量存在差异的内在原因，通过基于双向电泳的磷酸化蛋白质组实验，即利用Pro-Q Diamond试剂盒对双向电泳凝胶染色并采集图像，获得蛋白质点磷酸化的图谱，对磷酸化差异蛋白质点进行质谱鉴定，获得氨基酸磷酸化的信息。
　　本研究主要内容包括：⑴采用氯化钙—旋光法测定木薯块根淀粉含量，结果表明三个品种(系)之间淀粉含量差异显著，由高到低依次为SC5、W14及CAS36-12。⑵通过Western blot分析SC5、CAS36-12和W14块根中与淀粉代谢密切相关的蛋白酶AGPase和与糖代谢密切相关的蛋白酶UGPase的表达水平，表明SC5的AGPase表达水平最高，且显著高于其它两个品种(系)，糖木薯CAS36-12的AGPase表达水平高于W14，但差异并不显著。W14 UGPase表达水平显著高于其它两个品种，SC5的UGPase表达水平稍高于糖木薯CAS36-12，但差异微小。⑶通过qRT-PCR分析木薯块根与淀粉合成通路相关的基因SS1、SBE1、SBE2-1、SBE2-2、SBE3、SBE4以及SBE5在三个品种(系)块根中的表达情况，表明这7种基因在CAS36-12和W14块根中的表达水平相对于SC5都呈现下调表达，但基因SBE1的表达量在SC5和CAS36-12块根之间没有显著性差异(P>0.05)。同时7种基因在W14块根中的表达水平相较于CAS36-12都呈现下调，但基因SBE4和SBE5的表达量在CAS36-12和W14块根之间没有显著性差异(P>0.05)。⑷共选择100个磷酸化蛋白点进行质谱鉴定，分析磷酸化位点情况，依据模式植物拟南芥的蛋白质相互作用数据库，利用在线软件STRING10构建磷酸化蛋白质的生物互作调控网络。该网络包含26个蛋白质节点，一共有60种互作关系。在这个互作调控网络中，互作较强的蛋白质功能主要为伴侣分子(6个)、碳代谢和能量代谢相关蛋白质(5个)、与结构相关的蛋白质(5个)、排毒和抗氧化相关蛋白质(2个)和蛋白质生物合成相关蛋白质(1个)。木薯块根代谢的调控是一个非常复杂过程，众多磷酸化蛋白质一起参与相互协同作用。⑸蛋白质磷酸化程度差异分析得出果糖二磷酸醛缩酶、果糖激酶，核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶、烯醇化酶，α-1,4葡聚糖磷酸化酶L同工酶、AGPase大亚基蛋白等蛋白质的磷酸化直接或间接影响淀粉代谢，通过分析蛋白质磷酸化程度与蛋白质表达水平间的关系，发现正相关、负相关和无关这几种关系都存在，说明蛋白质磷酸化程度与蛋白质表达水平间不存在某种确定的联系。

目录

声明

缩略语表(Abbreviations)

1 前言

1.1 植物蛋白质磷酸化研究进展

1.2 磷酸化蛋白质组学的定义及研究方法

1.3 植物淀粉代谢及其调控研究进展

1.4 木薯淀粉代谢调控研究进展

1.5 木薯磷酸化蛋白质组研究进展

1.6 本研究的目的和意义

2.1 材料

2.2 实验方法

3结果与分析

3.1 木薯块根成熟阶段淀粉含量分析

3.2 木薯块根淀粉代谢相关酶表达水平分析

3.3 木薯块根淀粉代谢关键基因表达水平分析

3.4 木薯块根磷酸化蛋白质组学分析

4 讨论与展望

4.1 不同木薯的成熟期块根AGPase和UCPase表达水平分析

4.2 不同木薯的成熟期块根基因SS1、SBE1、SBE2-1、SBE2-2、SBE3、SBE4以及SBE5表达水平分析

4.3 成熟期木薯块根的蛋白质磷酸化情况分析

4.4 不同成熟期木薯块根的差异磷酸化蛋白质分析

4.5 展望

参考文献

附录

致谢