转录组测序解析氨气刺激后仔猪呼吸道和肝脏转录谱的变化

摘要

氨气是规模化猪场中普遍存在的有毒有害气体之一，较高浓度的氨气会给仔猪和工作人员带来健康隐患，而目前关于氨气影响仔猪健康的研究尚不足。本研究选取7周龄14 kg的保育仔猪共12头，随机分为4组，用56 mg/m3左右的氨气对3个试验组分别刺激4天、8天和12天，对照组则不作处理。刺激结束后采集仔猪肺，鼻黏膜和肝脏组织，提取总RNA，然后对这4个时期的样品进行转录组测序(RNA-seq)，并探讨氨气刺激对3个组织转录谱的影响。
　　主要结果:
　　1.分别鉴定了3个组织氨气刺激前后的差异表达基因（默认和较小天数组比），肺和鼻黏膜一共6个比较(NC与3个处理组间的比较，3个处理组间的两两比较)，肝脏只有1个比较（D12比NC）。统计显示:肺的差异表达基因一共有289个，鼻黏膜则有825个，肝脏有589个（367个上调表达，222个下调表达）。
　　2.构建了肺和鼻黏膜差异表达基因的表达模式，并对每个模式的基因进行了功能富集分析。肺的差异表达基因一共被分为18类，其中SCGB3A2，MMPs，PIFA1，IL8，ARG2，COMP，PAL-1，COLs，CLCA1，ELANE等与肺纤维化发生和气道黏液分泌相关的基因大部分处于cluster1，cluster2和cluster3中。鼻黏膜的差异表达基因被分为了20类，其中cluster1，cluster2，cluster3和cluster6中CCDCs，CFAPs，TEKTs，DNAHs，LRRCs，SPAG17，COL11A2，ACAN，SNTN与黏膜功能、结构有关;cluster4中SFTPs，BPIFBs与呼吸功能及防御反应相关;cluster7中MASP1，LBP，C4BPA，IL1B，REG3G，S100As与急性炎症和黏液分泌有关;cluster8和cluster9的PAI-1，MMPs，KRTs还与上皮修复有关。
　　3.肝脏差异表达基因显著富集的通路(p≤0.05)与免疫，癌症，肝病，氨基酸代谢及生理节奏有关。蛋白互作分析表明PIK3CA，TNF，NFKBIA，THBS1，JUN，HIF1A和FOS可能是重要的调控因子。
　　4.鉴定了NC组和D12组间的差异可变剪切及差异表达转录本。结果显示CD40、SAT1、ETFB、CLK1、CHTOP和TNFRSF1A在鼻黏膜或者肺NC组和D12处理组间具有显著差异(FDR≤0.05)的可变剪接事件。同时，分别在肺、鼻黏膜和肝脏上发现了数量不等的差异表达(FDR≤0.05)的转录本。功能分析表明以上基因大部分与免疫，细胞凋亡和癌症有关。
　　5.用22个样品的转录组测序数据鉴定了903条新lincRNA，并用权重基因共表达网络整合分析（Weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）差异表达的linc基因和编码基因（共3072个）。结果显示LIPG在肝脏D12特异性高表达，TF在肝脏NC组特异性高表达;而新lincRNA XLOC_004910则在鼻黏膜D12特异性高表达，其临近的9个编码基因（上下游100kb）则与免疫，糖/激素代谢，造血有关，暗示该lincRNA可能参与了这些进程。
　　主要结论:
　　氨气刺激引起仔猪鼻黏膜、肺和肝脏组织大量基因上调表达，其中刺激12天后差异表达基因数目最多。这些差异表达基因主要参与了呼吸道重塑、氧化应激、炎症和免疫应答等生物学进程。同时发现基因的选择性剪切和lincRNA在仔猪应对氨气刺激过程中也可能发挥重要的调控作用。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表(Abbreviations)

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 猪舍中氨的产生及危害

1．3 不同浓度氨气对呼吸道和肝脏的影响

1．4 转录组测序技术的发展及研究手段

1．5 转录组中非编码RNA的研究进展

1．6 转录组测序在氨气刺激模型中的应用

1．7 研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．4 生物信息学软件、数据库

2．2 方法

2．2．1 本研究的技术路线

2．2．2 氨气刺激及组织样品采集

2．2．3 组织样总RNA抽提及质量检测

2．2．4 文库构建及转录组测序

2．2．5 测序数据处理与分析

3 结果

3．1 测序数据统计

3．1．1 测序数据产出及质量统计

3．1．2 读长比对统计

3．1．3 基因表达量统计

3．1．4 测序样品相关性检查

3．2 差异表达基因鉴定

3．3 肺和鼻黏膜差异基因功能分析

3．3．1 差异基因聚类

3．3．2 差异基因表达模式

3．3．3 KEGG和GO富集

3．4 肝脏差异基因功能分析

3．4．1 KEGG和GO富集

3．4．2 差异表达基因蛋白互作

3．4．3 Top 60差异表达基因和差异TFs间的互作

3．5 WGCNA整合分析mRNA和lincRNA

3．5．1 LincRNA鉴定及特征分析

3．5．2 LincRNA和mRNA定量及筛选

3．5．3 WGCNA构建模块

3．5．4 模块功能注释

3．6 差异可变剪接鉴定

4 讨论

4．1 呼吸道、肝脏转录谱变化

4．1．1 肺转录谱变化

4．1．2 鼻黏膜转录谱变化

4．1．3 肝脏转录谱变化

4．2 差异可变剪接功能分析

4．3 整合分析发现新的调控因子

5 小结

5．1 本研究的主要结论

5．2 本研究的创新点

5．3 本研究的不足之处与下一步工作计划

参考文献

附录

致谢