组蛋白修饰和DNA甲基化调控水稻发育的表观遗传机制研究

摘要

表观修饰在维持真核生物基因组稳定、调控基因表达等方面发挥了重要作用。作为主要粮食作物的水稻，其各器官（如根、叶和穗）发育过程中的表观调控机制及其与基因表达的关系的认知还有待完善，表观修饰之间之间的相互关系还不是很清楚。本文分别将从以下三个方面探究了表观修饰（组蛋白修饰和DNA甲基化）之间的内在关系，并深入探讨了它们在调控水稻基因表达和发育方面的作用:1.穗原基分生组织(IM，Infloresence Meristem)中组蛋白甲基化与基因表达重编程关系的研究;2.水稻叶片中组蛋白H3K27me3与DNA甲基化修饰在协同抑制功能基因表达方面的研究;3.组蛋白乙酰化修饰在调控水稻冠根发育过程中的作用机制研究。主要研究结果如下:
　　a.水稻穗原基分生组织的活性直接关系到水稻穗发育和粮食产量，但表观修饰是如何调控穗原基分生组织发育和基因表达的还不是很清楚。我们通过高通量数据分析发现，水稻成花转变（由茎顶端分生组织到穗原基分生组织）过程中大量转录因子（如MADS、AP2、AUX/IAA等）、激酶、碳代谢、蛋白合成等相关基因的表达量上调或改变，而组蛋白修饰H3K27me3/H3K4me3的相对变化比例则直接影响了该发育过程中的基因表达变化。成花转变过程中，水稻茎顶端分生组织全基因组中大量基因的H3K27me3修饰发生了重编程，而SDG711(H3K27甲基转移酶编码基因)和JMJ703（H3K4去甲基化酶编码基因）抑制表达或突变后减弱了H3K27me3修饰基因增加的情况。其中SDG711介导的H3K27me3参与了多个穗发育关键基因的表达抑制调控，并保证了部分花发育后期或者其他时期才被激活表达的基因在穗原基中的沉默状态。以上数据表明SDG711和JMJ703共同参与了维持了穗原基中H3K27me3/H3K4me3修饰状态进而调控了基因的正常表达。
　　b.H3K27me3是由PRC2复合物催化的基因表达抑制标志，DNA甲基化是转座子沉默的标志，但是水稻中这两种修饰之间的关系、二者又是如何协同维持基因表达沉默的，以及植物中PRC2复合物的招募机制都还不是很清楚。我们通过高通量数据分析发现，水稻叶片形成过程中SDG711参与了对多种功能基因的H3K27me3修饰。同时我们也发现，水稻叶片中大量H3K27me3修饰的功能基因的gene body（由转录起始位点到转录终止位点）上含有non-CG（CHG和CHH）甲基化。SDG711超表达后产生的异位H3K27me3修饰基因和SDG711结合的基因上均含有较高的non-CG甲基化，同时生物化学实验显示SDG711能与OsDRM2（CHH甲基转移酶）和含有SRA结构域（特异性结合甲基化的CHG位点）的SDG703直接互作。osdrm2突变体中全基因组H3K27me3修饰下降。这些研究结果表明在水稻叶片中SDG711介导的H3K27me3和DRM2介导的non-CG甲基化共同参与了功能基因表达的抑制，二者在水稻体内可能具有一定的协同促进作用。
　　c.冠根是水稻根的主要类型，Homeobox家族成员WOX11是调控水稻冠根发育的关键转录因子，在调控水稻冠根的起始和伸长中发挥了重要功能。我们研究发现，水稻冠根分生区中WOX11可以直接招募ADA2-GCN5乙酰化酶复合物并激活下游基因的表达。原位杂交显示GCN5和ADA2均在冠根根尖分生区各层细胞中存在表达，GCN5和ADA2表达量被抑制后均影响了水稻冠根的起始、伸长。进一步分析发现wox11突变体和GCN5 RNAi植株根中生长素信号应答减弱、根尖细胞分裂速率降低。下游基因检测发现，WOX11和ADA2-GCN5直接参与调控了生长素转运和应答、纤维素合成和能量代谢相关基因在水稻冠根中的表达。这些数据说明对ADA2-GCN5乙酰化酶复合物的招募是WOX11调控下游基因表达的重要方式，它们的互作关系保证了水稻冠根分生区基因的正常表达、维持了分生区细胞的分裂活性并最终促进了水稻冠根的发育。

目录

声明

摘要

缩略词表(Abbreviations and Acronyms)

1 前言

1．1 表观调控和表观遗传

1．2 组蛋白修饰

1．2．1 组蛋白乙酰化修饰

1．2．2 组蛋白甲基化修饰

1．3 DNA甲基化修饰

1．3．1 DNA甲基化形式及分布

1．3．3 DNA甲基化起始机制

1．3．4 DNA甲基化的维持和去除

1．4 表观修饰的相互关系

1．4．1 组蛋白修饰之间的相互影响

1．4．2 组蛋白修饰和DNA甲基化相互关系

1．5 表观基因组

1．6 植物顶端发育与表观调控

1．6．1 水稻穗和根发育

1．6．2 表观调控与植物花序、根发育

1．7 本研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 水稻材料

2．1．2 菌株

2．1．3 质粒

2．1．4 抗体

2．1．5 基因序列信息及登录号

2．2 实验方法

2．2．1 载体构建

2．2．2 农杆菌介导的水稻遗传转化

2．2．3 RNA抽提及表达量检测

2．2．4 染色质免疫共沉淀(CHIP，Chromatin Immunoprecipitation)

2．2．5 酵母中互作蛋白的筛选和验证

2．2．7 双分子荧光互补实验(BiFC，bimolecular flurescence complementation)

2．2．9 OsGCN5体外乙酰化酶活检测

2．2．10 组织包埋和mRNA原位杂交

2．2．11 根尖GUS染色和分生区长度测量

2．2．12 Edu(5-ethynyl-20-deoxyuridine)染色检测细胞有丝分裂频率

2．2．13 OsADA2抗体制备

2．2．14 水培实验

2．2．15 染色质免疫共沉淀测序(CHIP-seq)建库及数据分析

2．2．16 转录组测序(RNA-seq)建库及数据分析

2．2．17 重亚硫酸盐测序(BS-seq)及数据分析

2．2．18 代谢通路(Pathway)分析

2．2．19 基因的组织特异性表达分析

2．2．20 蛋白结合序列(motif)分析

2．2．21 本研究所用引物序列

3 结果与分析

3．1 水稻成花转变过程中的表观调控机制研究

3．1．1 组蛋白H3K27甲基化酶SDG711影响穗分生组织基因表达

3．1．2 水稻成花转变过程中的H3K27me3和H3K4me3分析

3．1．3 成花转变过程中差异H3K27me3和H3K4me3修饰基因

3．1．4 SDG711影响了水稻穗原基分生组织(IM)中的H3K27me3修饰

3．1．5 SDG711和JMJ703共同影响了全基因组H3K27me3修饰并调控了水稻穗发育

3．2 水稻叶片H3K27me3和non-CG甲基化协同抑制基因表达方面的研究

3．2．1 SDG711参与了茎顶端分生组织(SAM)到叶片发育过程中的H3K27me3重编程过程

3．2．2 水稻叶片中H3K27me3修饰基因上存在non-CG甲基化

3．2．3 SDG711结合的基因上存在non-CG甲基化

3．2．4 H3K27me3修饰在osdrm2中大量丢失

3．3 水稻乙酰转移酶GCN5在调控水稻冠根发育方面的研究

3．3．1 WOX11和组蛋白乙酰化酶复合体ADA2-GCN5互作

3．3．2 GCN5是一个广谱乙酰化酶，且和ADA2在根尖分生区高量表达

3．3．3抑制GCN5和ADA2后影响了水稻冠根的起始、伸长和植株高度

3．3．4 GCN5调控了水稻冠根根尖分生区大小和细胞分裂速率

3．3．5 GCN5和WOX11影响水稻根中生长素的分布(或应答)

3．3．6 GCN5 RNAi转录组分析

3．3．7 OsGCN5和WOX11共同调节水稻冠根代谢和激素相关基因的表达和乙酰化水平

4 讨论

4．1 水稻成花转变过程中茎顶端分生组织中的转录组和H3K27me3修饰重编程

4．2 SDG711介导的H3K27me3修饰维持了水稻穗原基分生组织的正常发育

4．3 组蛋白H3K4me3去甲基化酶JMJ703参与了SDG711介导的H3K27me3修饰过程

4．4 水稻中non-CG甲基化和H3K27me3之间的关系探讨

4．5 DNA甲基化对SDG711的招募机制探讨

4．6 WOX11-OsADA2-OsGCN5共同促进了水稻冠根发育

4．7 转录因子通过OsADA2(桥梁蛋白)招募乙酰转移酶复合物

参考文献

附录

作者简介

己发表的论文

已申请专利

会议摘要

致谢