东方巴贝斯虫TRAP2基因的克隆表达及其部分功能研究

摘要

东方巴贝斯虫(Babesia orientalis)是1984年新发现并证实的巴贝斯虫新种，临床研究表明其仅仅对水牛有较严重的致病性，并由镰形扇头蜱经卵传递，主要分布在我国长江以南的区域。患病动物临床表现为贫血、高热、黄疸和血红蛋白尿等症状，严重时会导致死亡，对我国南方农业生产和水牛养殖业造成严重威胁。当前，水牛巴贝斯虫病的防治还是传统的用药物涂抹防治，治疗效果很不理想，而临床用于防控治疗东方巴贝斯虫病疫苗鲜有报道，对虫体侵染宿主相关的关键分子研究也不系统。
　　基于此，本研究选取已经在顶复门类原虫中确定的关键入侵分子TRAP蛋白为研究对象，从现有的东方巴贝斯虫基因库里钓取了东方巴贝斯虫凝血酶敏感素相关无名蛋白2(Babesia orientalis Thrombospondin-related anonymous protein2，BoTRAP2)基因信息并进行克隆与分析，并探索了BoTRAP2蛋白与水牛红细胞膜蛋白的互作，BoTRAP2蛋白及其结构域在与肝素的结合时的功能特点，最后对BoTRAP2蛋白晶体的形成也进行了尝试。
　　(1)东方巴贝斯虫TRAP2基因的克隆、表达和生物信息学分析
　　通过序列比对在东方巴贝斯虫全基因库中查找到了一段和牛巴贝斯虫TRAP2基因序列(XM_001609762.1)同源性极高的序列。设计特异性的引物在东方巴贝斯虫全基因库中扩增到一条2817bp的片段，对该核苷酸序列进行生物信息学分析，发现其含有2段vWFA结构域、2段TSP结构域、1段MIADS结构性域、1段横跨膜结构域，与典型的TRAP样家族核苷酸结构非常吻合，表明该基因序列为东方巴贝斯虫TRAP2基因。同源性分析表明该氨基酸序列与牛巴贝斯虫TRAP2氨基酸序列的同源性高达94％，生物信息学软件分析表明该蛋白具有很好的抗原性。
　　(2)东方巴贝斯虫TRAP2蛋白和红细胞膜蛋白的相互作用
　　选取TRAP2蛋白的关键结构域（含有vWFA、TSP、MIADS关键序列区域）进行截短表达，设计含有合适酶切位点特异性的引物克隆TRAP2-vWFA-TSP，构建含单一His标签的原核表达质粒pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP，转入BL21表达菌株中。经过探索，在18℃、100rpm、IPTG浓度1.0mM、培养15h能得到高效表达在上清液的蛋白，通过镍柱纯化能获得高纯度的目的蛋白。Far-western验证重组TRAP2-vWFA-TSP蛋白与红细胞膜蛋白的互作，结果显示在红细胞膜蛋白上有一条疑似目的条带，表明东方巴贝斯虫TRAP2蛋白与红细胞膜表面的某一蛋白有一定的结合作用。
　　(3)东方巴贝斯虫TRAP2蛋白及其结构域和肝素的粘附结合
　　分别构建pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP、pET-28a-TRAP2-vWFA、pET-28a-TRAP2-TSP原核表达质粒，转入BL21表达菌株中，经过探索，获得了大量高纯度的重组TRAP2-vWFA-TSP、TRAP2-vWFA、TRAP2-TSP蛋白，通过ELISA验证TRAP2蛋白及其结构域与肝素的相互作用。结果显示TRAP2蛋白及其结构域与肝素都有很好的结合，并且TRAP2-vWFA-TSP蛋白与肝素的结合亲和力强于单独的TRAP2-vWFA、TRAP2-TSP蛋白与肝素结合的亲和力之和，这也表明了在TRAP2蛋白与肝素结合时其单个结构域可能起着协同作用。
　　(4)东方巴贝斯虫TRAP2蛋白晶体的初筛
　　将纯化后的截短pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP蛋白用型号为GE Superdx200pg分子筛纯化柱再次纯化，依据分子筛的运行图得知pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP蛋白以二聚体复合物的形式存在，经过分子筛纯化浓缩后能得到蛋白浓度为9mg/mL、纯度＞90％的目的蛋白，经过商业化结晶板进行初筛得到疑似蛋白晶体的小晶块，通过改变Buffer缓冲液中的盐离子、沉淀剂的浓度来进行优化，实验未得到理想的结果，需要进一步摸索条件。
　　本课题成功克隆了东方巴贝斯虫的TRAP2基因并进行了生物信息学分析，利用原核表达系统表达了BoTRAP2基因的关键结构域，验证了BoTRAP2蛋白抗原性及BoTRAP2蛋白与红细胞膜蛋白的互作，证实了TRAP2蛋白及其结构域蛋白与肝素存在的特异性结合。上述实验结果，对深入探讨巴贝斯虫入侵宿主的分子机制及对巴贝斯虫病的免疫预防研究具有重要意义。

目录

声明

摘要

缩略语表

缩略语表(续表)

1 文献综述

1．1 顶复门类原虫入侵机制的研究概述

1．2 凝血酶敏感素相关无名蛋白的研究进展

1．2．1 凝血酶敏感素相关无名蛋白的概述

1．2．2 顶复门类原虫中凝血酶敏感素相关无名蛋白的生物学功能研究

1．2．3 凝血酶敏感素相关无名蛋白的晶体结构概述

1．2．4 凝血酶敏感素相关无名蛋白的生物学作用

2 研究的背景与目的意义

2．1 研究背景

2．2 研究目的

3 材料与方法

3．1 试验材料

3．1．1 虫株、血清和试验动物

3．1．2 菌种与质粒

3．1．3 酶和主要试剂

3．1．4 抗生素和培养基的配制

3．1．5 主要溶液的配制

3．1．6 仪器和设备

3．2 试验方法

3．2．1 生物信息学分析方法和工具

3．2．2 引物的设计

3．2．4 东方巴贝斯虫TRAP2基因及截短结构域的PCR扩增和克隆测序

3．2．5 系统进化分析

3．2．6 东方巴贝斯虫总RNA的提取

3．2．7 RT-PCR扩增东方巴贝斯虫TRAP2基因的结构域

3．2．8 重组表达质粒的构建

3．2．9 重组蛋白的原核表达及纯化

3．2．10 水牛红细胞膜蛋白的获取

3．2．11 多克隆血清的制备及多克隆抗体的纯化

3．2．12 Far-western bloting

3．2．13 TRAP2重组蛋白及其结构域与肝素的粘附结合

3．2．14 TRAP2重组蛋白与肝素的竞争抑制实验

3．2．15 TRAP2重组蛋白及其结构域与肝素的亲和力大小比较

3．2．16 TRAP2重组蛋白分子筛仪器的纯化

3．2．17 TRAP2重组蛋白分子筛纯化后晶体的初筛

4 结果与分析

4．1 BoTRAP2基因的序列扩增及测定

4．1．1 TRAP2基因的PCR扩增

4．1．2 TRAP2基因序列的测定

4．1．3 TRAP2序列的比对和分子进化分析

4．1．4 TRAP2序列的生物信息学分析

4．2 东方巴贝斯虫TRAP2截短结构域重组蛋白的表达、纯化

4．2．1 TRAP2-TSP-vWFA短肽蛋白的表达、纯化及抗原性

4．2．2 TRA2-vWFA及TRA2-TSP短肽蛋白的表达、纯化

4．4 TRAP2-vWFA-TSP短肽蛋白与红细胞膜蛋白的互作

4．5 TRAP2-vWFA-TSP短肽蛋白与肝素的特异性结合

4．5．2 ELISA验证TRAP2-vWFA-TSP短肽蛋白与肝素的粘附抑制

4．5．4 TRAP2-vWFA-TSP蛋白及其结构域与肝素粘附亲和力比较

4．6 TRAP2-vWFA-TSP短肽蛋白结晶条件的探索

4．6．2 TRAP2-vWFA-TSP短肽蛋白结晶条件的筛选

5 讨论

5．1 东方巴贝斯虫TRAP2基因的克隆及测序分析

5．2 东方巴贝斯虫TRAP2截短蛋白的表达及功能验证

5．3 东方巴贝斯虫TRAP2截短蛋白晶体的初筛

6 结论

参考文献

致谢

附录

论文说明