甘蓝型油菜SPX家族鉴定与BnaSPX1s功能及BnaC3.SPX3的调控研究

摘要

甘蓝型油菜是我国主要的油料作物，需磷多，对缺磷敏感，最大栽培区（长江中下游）又位于我国土壤磷缺乏或严重缺乏的地区。因此，研究甘蓝型油菜磷营养高效的遗传机理，对于甘蓝型油菜磷营养的遗传改良具有重要的理论和实践意义。含SPX保守结构域的基因对体内磷稳态的调节及磷信号调控的重要性在拟南芥和水稻中均有报道，但在其它作物中鲜有研究。本研究在全基因组水平上鉴定了甘蓝型油菜中所有含SPX保守结构域的基因（BnaSPXs），分析了SPX家族各成员的序列特征和响应磷胁迫的表达谱，并将BnaA2.SPX1和BnaC3.SPX1作为候选基因，对其潜在的调控磷信号的功能进行了研究。同时，以缺磷特异诱导表达基因BnaC3.SPX3为对象，对植物响应低磷的转录调控机制进行研究。获得的主要结果如下:
　　1、甘蓝型油菜SPX超家族基因成员的鉴定
　　甘蓝型油菜基因组中共有69个含SPX保守结构域的基因（BnaSPXs），其中67个基因不均匀地分布在甘蓝型油菜的18条染色体上，且大部分基因位于染色体的臂末端，预示着它们有很高的基因重组概率。A9染色体上分布最多（11个），A4染色体上分布最少（1个）。利用甘蓝型油菜和拟南芥SPX蛋白序列构建的系统进化树显示，SPX基因分成了4个亚家族，即SPX（11个成员）、SPX-EXS（43个成员）、SPX-MFS（8个成员）、SPX-RING亚家族（7个成员）。基因结构及蛋白保守结构域分析进一步证实了系统进化树结果的可靠性。对BnaSPXs基因启动子序列中的顺式作用元件进行分析，发现SPX亚家族基因成员（除去BnaSPX4s）的上游启动子中均含有2-4个P1BS（GNATATNC）元件。
　　2、甘蓝型油菜SPX基因响应低磷胁迫的表达模式
　　甘蓝型油菜苗期地上部和/或根部响应磷饥饿的转录组数据中，共检测到50个BnaSPXs基因的表达。其中，SPX亚家族基因（除去BnaSPX4s外），均受到磷饥饿的诱导。进一步的qRT-PCR表明，这种诱导具有持续性和可逆性。低磷下甘蓝型油菜不同组织部位的定量表达结果显示，甘蓝型油菜多倍化产生的重复基因间有不同的表达模式，说明在长期的进化过程中重复基因间产生了功能分化。
　　3、甘蓝型油菜BnaAZSPX1和BnaC3.SPX1基因响应低磷的功能
　　BnaA2.SPX1和BnaC3.SPX1在低磷胁迫下均受到诱导表达，且均为细胞核定位蛋白，但是在低磷胁迫下有不同的表达模式。pBnaA2.SPX1∷BnaA2.SPX1和pBnaC3.SPX1∷BnaC3.SPX1拟南芥转基因材料在正常磷（1000μM）和低磷(50μMPi)条件下的表型分析显示:低磷胁迫下pBnaA2.SPX1∷ BnaA2.SPX1转基因株系地上部干重和磷含量均低于野生型，许多磷饥饿诱导表达基因均受到显著抑制，表明BnaA2.SPX1是磷信号网络中的负调控因子。然而，BnaC3.SPX1的转基因材料与野生型相比，表型无明显变化。
　　4、甘蓝型油菜BnaC3.SPX3的调控模式
　　本课题组前期研究结果表明，BnaC3.SPX3为缺磷特异诱导表达基因，并且启动子上游-746至-326区域存在新的响应低磷胁迫的顺式作用元件。通过对该区域序列的分析，发现其中含有4个P1BS-like序列，即P1BS-like1（CTATATAC，-337/-330）、P1BS-like2(GTTTATAC,-387/-380)、P1BS-like3(ACATATGC,-672/-665)和P1BS-like4(GGGTATGC，-708/-701)，所以命名该段序列为LZ(Like Zone)序列。LZ的缺失分析表明近端的两个P1BS-like元件及其边框序列(LZ5△)具有独立响应低磷胁迫的能力。此外，该DNA序列保留了BnaC3.SPX3响应Pi饥饿诱导的快速性、持续性和可逆性特点。进一步通过GUS组织化学法研究LZ5△序列响应低磷胁迫的表达模式，发现LZ5△∷GUS转基因拟南芥的地上部、根、花器官及荚果中均有报告基因的表达。LZ5△内含的两个P1BS-like元件和边框序列对其增强子的功能是必需的和充分的。双荧光素酶检测结果表明，该DNA序列能与PHR1、PHL1、PHL2和PHL2等MYB-CC家族转录因子成员结合并受到它们的转录激活调控。
　　综上所述，本研究首次从全基因水平上分析了甘蓝型油菜中SPX家族基因的进化和响应低磷胁迫的表达谱，为后期BnaSPXs基因功能的深入研究奠定了基础。两个BnaSPX1s旁系同源基因在拟南芥中的功能差异可能由启动子差异所导致，显示异源四倍体物种在进化过程中同源基因功能的分化。BnaC3.SPX3启动子的缺失分析揭示近端的P1BS-like/P1BS-like及其边框序列组成的结构具有独立响应低磷胁迫的能力，并且这种结构是P1BS元件的“助推剂”，能够协助P1BS元件高效启动缺磷响应基因的表达。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

1 文献综述

1．1 植物磷营养研究概述

1．2 植物响应低磷胁迫的适应机制

1．2．1 根系形态学适应

1．2．2 根际的酸化

1．2．3 缺磷条件下植物代谢途径的改变

1．3 高等植物响应低磷胁迫的调控网络研究进展

1．3．1 磷信号网络中的各类转录因子

1．3．2 microRNAs和非编码RNA

1．3．3 含SPX保守结构域的基因

1．3．4 顺式作用元件对基因表达调控的影响

2 研究意义、目的和内容

2．1 研究意义

2．2 研究目的

2．3 研究内容

2．4 技术路线

3 甘蓝型油菜SPX超家族基因的全基因组鉴定

3．1 材料与方法

3．1．1 转录组测序材料及培养方法

3．1．2 SPX超家族成员的鉴定及其蛋白的理化性质

3．1．3 SPX基因的染色体分布、串联重复及线性化分析

3．1．4 SPX蛋白的分类和系统进化树构建

3．1．5 SPX家族成员的基因结构及保守结构域分析

3．1．6 SPX基因启动子区域潜在顺式作用元件的分析

3．1．7 苗期磷饥饿胁迫转录谱中的SPX家族基因差异表达分析

3．2 结果与分析

3．2．1 甘蓝型油菜SPX基因的鉴定及其序列特征分析

3．2．2 甘蓝型油菜SPX基因的染色体分布及基因复制特征

3．2．3 甘蓝型油菜SPX家族成员的系统进化特征

3．2．4 甘蓝型油菜SPX家族成员的基因结构和保守基序

3．2．5 甘蓝型油菜SPX家族基因启动子区域顾式作用元件的预测

3．2．6 甘蓝型油菜SPX家族基因响应缺磷胁迫的转录组分析

3．3 讨论

3．3．1 甘蓝型油菜SPX基因的进化特点

3．3．2 甘蓝型油菜SPX家族基因的功能预测

4 甘蓝型油菜BnaSPX1s基因响应低磷胁迫的功能分析

4．1 材料与方法

4．1．1 植物材料

4．1．2 菌株、质粒和试剂

4．1．3 常用培养基及溶液配制

4．1．4 材料培养

4．1．5 CTAB法提取基因组DNA

4．1．6 植株总RNA的提取

4．1．7 逆转录

4．1．8 定量RT-PCR检测基因的表达

4．1．9 遗传转化载体的构建和转化

4．1．10 转基因材料的获得

4．1．11 GUS染色

4．1．12 瞬时转化烟草体系

4．1．13 转基因拟南芥全磷含量的测定(钼锑抗比色法)

4．1．14 数据的统计分析

4．2 结果与分析

4．2．1 SPX亚家族基因响应磷饥饿的时空表达模式

4．2．2 低磷胁迫下SPX亚家族基因的器官组织表达模式

4．2．3 低磷胁迫下BnaSPX1s候选基因的GUS组织定位

4．2．4 甘蓝型油菜BnaSPX1s在拟南芥中的功能研究

4．2．5 甘蓝型油菜SPX成员的亚细胞定位分析

4．3 讨论

5 甘蓝型油菜缺磷诱导表达BnaC3SPX3基因的调控研究

5．1 材料与方法

5．1．1 植物材料

5．1．2 菌株和质粒

5．1．3 材料培养

5．1．4 启动子缺失及突变材料GUS酶活性检测

5．1．5 烟草双荧光素酶瞬时表达分析

5．2 结果与分析

5．2．1 BnaC3．SPX3基因上游启动子顺式作用元件的预测

5．2．2 BnaC3．SPX3基因上游启动子的缺失分析

5．2．3 BnaC3．SPX3启动子中LZ的低磷胁迫响应

5．2．4 LZ5Δ发挥增强子作用的功能元件

5．2．5 BnaC3．SPX3上游调控因子的鉴定

5．3 讨论

6 研究总结与展望

6．1 研究总结

6．2 本研究的主要创新点

6．4 研究展望

附录

参考文献

致谢

个人简介

研究生期间发表及拟发表的文章

参加的学术会议