根中优势表达启动子的筛选和GhCPK33在棉花抗黄萎病中的功能研究

摘要

植物的生长和抗性通常处于对立的地位，植物免疫系统的激活通常影响生长发育，从而影响作物的产量，因此抗病基因在抗病育种上的应用需要有精确的时空表达调控元件，一方面可以使作物获得抗性，另一方面不影响作物的产量。组织特异型启动子使抗性基因仅在特异的组织中表达，从而使植株获得抗性的同时能够正常生长。
　　依赖于钙离子的蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPKs）不仅在生长发育中具有重要作用，在植物的免疫系统中也具有重要的作用。前期工作是对棉花参与JA合成的GhOPR3(1，2-氧-植物二烯酸(OPDA)还原酶）酵母双杂交结果进行分析，获得一个与GhOPR3互作的蛋白，同源比对分析后发现该蛋白的编码基因与GhCPK33like相似度度最高，因此命名为GhCPK33。
　　本研究开展了棉花根优势表达启动子的分离与鉴定，并对GhCPK33的在棉花抗病方面的功能进行了初步探究，取得的主要结果如下:
　　1.我们通过海岛棉组织表达数据库分析，筛选到22个可能在根中优势表达的基因，并克隆了这些基因。通过PCR扩增，获得了2个根优势表达的启动子，构建了表达载体分别转化拟南芥和棉花。
　　2.表达分析发现GhCPK33在棉花的各个组织中均有表达，接种黄萎病菌后GhCPK33的表达变化不明显;Me-JA处理1h时该基因的表达量明显增加，但对于外源SA的处理，该基因的响应没有明显的规律。
　　3.利用病毒诱导的基因沉默技术在海岛棉中抑制GhCPK33基因的表达后，增强了植株对黄萎病的抗性;同时发现在GhCPK33表达量下调的棉株中内源茉莉酸活化形式荣莉酸异亮氨酸的含量升高，并且JA信号路径的关键基因被激活;接种死体营养型真菌-灰霉菌后发现，GhCPK33表达量下调后增强了植株对灰霉菌的抗性。因此推测该基因可能通过影响茉莉酸信号路径来调控棉花对黄萎病的抗性。
　　筛选根中优势表达的启动子，利用该启动子驱动抗性基因，如GhCPK33，在根中优势表达，是目前获得抗性品种的一个好的方法和方向。

目录

声明

摘要

缩略语表

1 文献综述

1．1 黄萎病与黄萎病菌的概述

1．2 植物免疫反应

1．2．1 先天性植物免疫系统

1．2．2 依赖于R基因的免疫反应

1．2．3 激素信号路径介导的抗病反应

1．2．4 依赖于钙离子的蛋白激酶在植物免疫系统中的作用

1．3 植物启动子的研究现状

1．3．1 启动子的分类

1．3．2 组织特异型启动子的应用及研究现状

1．4 本课题研究的目的和意义

2 材料方法

2．1 实验材料

2．1．1 基因来源

2．1．2 植物材料

2．1．3 主要菌株和载体

2．1．4 主要酶类和试剂

2．2 实验方法

2．2．1 根中优势表达启动子和GhCPK33的序列分析

2．2．2 GhCPK33表达模式分析

2．2．3 棉花根系RNA的提取及浓度测定

2．2．4 反转录总RNA合成cDNA

2．2．5 RT-PCR和qRT-PCR分析

2．2．6 启动子连接GUS报告基因的载体构建

2．2．7 VIGS载体构建

2．2．8 棉花幼苗培育

2．2．9 棉花幼苗的VIGS处理

2．2．10 激素含量测定

2．2．11 棉花黄萎病病原菌的活化及培养

2．2．12 棉花黄萎病菌的接种

2．2．13 棉花幼苗接种黄萎病菌后发病率及病指统计

2．2．14 接菌后对棉株剖秆观察及茎段恢复培养及菌量检测

2．2．15 GhCPK33表达被抑制后的对灰霉菌的抗性鉴定

2．2．16 转基因拟南芥及转基因鉴定

3 结果与分析

3．1 根中优势表达启动子的结果

3．1．1 根中优势表达启动子的来源

3．1．2 根中优势表达基因在棉花各个组织中RT-PCR结果

3．1．3 根中优势表达基因的启动子(Gbscaffold12396．4P和Gbscaffold4369．10P)的克隆及结构特点

3．2 GhCPK33在棉花抗黄萎病方面的功能研究

3．2．1 GhCPK33的基因来源

3．2．2 GhCPK33的结构特点及进化树的构建

3．2．3 GhCPK33的表达模式分析

3．2．4 激素处理后GhCPK33的表达模式

3．2．5 VIGS沉默目标基因后海岛棉棉株表型

4 讨论与结论

4．1 根中优势表达启动子的选择

4．2 GhCPK33在棉花抗黄萎病菌中的作用

参考文献

附录

致谢