利用pag1突变体研究BRs调控棉花抗旱性的作用机制

摘要

干旱是危害农业生产的全球性问题。我国是世界上最大的棉花生产国，且棉花在国民经济和社会发展中占有重要地位。但是，我国土地面积的一半以上都处于干旱和半干旱地区，而且我国具有人多地少、粮棉争地矛盾突出的现状。所以，在“不与粮争田”的前提下，抗旱棉花新品种的培育和发展旱地植棉将是我国实现粮棉双丰收的重要途径。
　　棉花是目前世界上种植面积最大的抗旱先锋作物，其在进化上可能具有独特的抗旱机制。有报道表明激素油菜素甾醇类化合物(BRs，brassinosteroids)不仅在植物的生长发育方面发挥着重要作用，而且参与植物的逆境胁迫响应。同时，亚洲棉、雷蒙德氏棉和陆地棉的全基因组已测序完成。在此背景下，利用现代分子生物学技术，研究BRs参与调控的棉花抗旱机制，克隆棉花新的抗旱相关基因以培育优良的棉花抗旱新品种，对我国棉花产业的稳定发展具有重要意义。
　　本论文利用本实验室的一个棉花BRs缺失突变体pag1开展研究，结果如下:
　　1)首先，利用土培法研究pag1的抗旱性实验结果表明pag1对干旱胁迫较为敏感且存活率显著低于对照CCRI24（中24）。在水培条件下，用6％PEG6000模拟干旱处理上述材料也得到了同样的结果，并且用24-epi-BL（24-表-油菜素内酯）处理的pag1的存活率显著高于pag1。
　　2)进一步研究发现，pag1的主根长度和侧根数目均显著小于对照CCRI24，并且用24-epi-BL处理pag1可显著增加其主根长度和侧根数目。根系生物量的统计发现，无论是干重还是鲜重，pag1的根系生物量均显著低于对照CCRI24和24-epi-BL处理的pag1。对影响根系发育的生长素运输载体GhPIN2和GhLAX3的研究发现，他们的基因表达量在pag1中均低于对照CCRI24和24-epi-BL处理的pag1。
　　3)对叶片气孔的研究发现，pag1的叶片气孔密度显著高于对照CCRI24，而使用24-epi-BL喷施处理pag1的叶片可以显著降低其气孔密度;气孔开度研究结果表明，在ABA处理后pag1的气孔开度显著大于对照CCRI24的气孔开度，但是24-epi-BL处理的pag1叶片的气孔开度显著变小。ABA是调控逆境胁迫重要的植物激素，对其含量测定结果显示，pag1中的ABA含量显著低于对照CCRI24和24-epi-BL处理的pag1。
　　4)对干旱胁迫相关的基因的表达量检测结果显示，在干旱胁迫条件下，CDPK1，NCED3，ERD10和LEA在CCRI24和24-epi-BL处理pag1中的表达量均显著高于pag1。虽然ERD1，RD22和RD26只有在CCRI24中的表达量显著高于pag1，但是在24-epi-BL处理pag1中的表达量也略高于在pag1中的表达量。
　　5)光合作用速率测定结果显示，pag1的光合速率显著低于对照CCRI24和24-epi-BL处理的pag1。生物量统计结果显示，无论是干重还是鲜重，pag1的生物量显著低于对照CCRI24和24-epi-BL处理的pag1。同时，透射电子显微镜观察结果显示pag1叶绿体中无淀粉粒的积累，而对照CCRI24和24-epi-BL处理的pag1中均有淀粉粒积累，且叶片淀粉染色也得到同样的结果。农艺性状的调查结果显示，无论在正常还是干旱条件下，BRs缺失突变体pag1在株高、果枝数、桃数和籽棉产量方面均显著低于对照CCRI24和24-epi-BL处理pag1。
　　6)为了进一步揭示BRs调控棉花耐旱性的作用机制，我们采用iTRAQ方法检测6％ PEG6000处理0h，12h，24 h，36 h条件下的pag1和CCRI24中的差异蛋白，在pag1/CCRI24＞±1.2(P value＜0.05)的筛选条件下共鉴定到2100个差异蛋白，其中上调蛋白数目为1132个，下调蛋白数目为1105个，上调和下调共同拥有蛋白数目为137个。GO(Gene ontology)分析显示上调蛋白主要聚类于细胞进程、代谢过程和刺激响应等12类中，下调表达的差异蛋白主要聚类于刺激响应、大分子复合物和代谢过程等13类中。在下调表达的差异蛋白中，有许多是参与干旱胁迫响应的，例如ascorbateperoxidase(CotAD_01708), dehydrin erd10-1ike protein(CotAD_58358), nadhdehydrogenase(CotAD_48405), peroxidase60(CotAD_42424), abscisic acidreceptor PYR1-like(CotAD_03959), superoxide dismutase(CotAD_51044),pyrroline-5-carboxylate reductase(CotAD_22901)等等。
　　本研究利用棉花BRs缺失突变体pag1，从根系、气孔、能量合成、基因表达和蛋白组学等方面全面揭示了BRs缺失造成植物对干旱胁迫敏感的作用机制，使我们认识了BRs在生长发育和干旱胁迫中的重要作用，为我们如何利用植物激素BRs和为我们利用分子生物学方法克隆BRs相关基因以培育抗旱性强、高产稳产的棉花新品种提供了重要的理论依据。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 研究问题的由来

1．2 文献综述

1．2．1 棉花耐旱性研究进展

1．2．2 植物激素与抗旱性的关系

1．2．3 BRs的研究进展

1．2．4 PAG1的研究进展

1．3 本文的研究目的及意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 土培法鉴定棉花的抗旱性

2．3 棉花水培培养法

2．4 水培法鉴定棉花的抗旱性

2．5 棉花整株鲜重与干重的测定

2．6 棉花主根长度与侧根数目的测定

2．7 棉花幼根鲜重与干重的测定

2．8 棉花幼根石蜡切片的制各

2．9 棉花叶片气孔开度的测定

2．10 棉花叶片气孔密度的测定

2．11 棉花离体叶片失水率测定

2．12 ABA含量测定

2．13 光合作用测定

2．14 RNA提取

2．15 逆转录

2．16 实时定量PCR反应

2．17 淀粉染色

2．18 透射电镜切片的制备

2．19 透射电镜观察叶片的淀粉积累

2．20 蛋白质组学测定(iTRAQ法)

2．20．1 测定材料的准备

2．20．2 蛋白质制备方法

2．20．3 酶解和肽段定量

2．20．4 肽段标记

2．20．5 质谱分析

2．20．6 数据分析

2．21 功能分类和聚类分析

2．22 差异蛋白的维恩图绘制

2．23 差异相关蛋白的热图绘制

2．24 抗旱相关基因的筛选

2．25 正常及干旱条件下棉花相关农艺性状的鉴定

3 结果与分析

3．1．2 水培法鉴定pag1的抗旱性

3．2 BRs缺失影响pag1突变体根系的发育

3．2．2 BRs缺失影响pag1的根系生物量

3．2．3 BRs缺失影响pag1的根系细胞结构

3．2．4 BRs缺失影响pag1根系中生长素相关基因的表达

3．3 BRs的缺失影响pag1的气孔发育和机能

3．3．2 BRs的缺失增加pag1的叶片气孔密度

3．3．3 BRs的缺失阻碍pag1的气孔关闭

3．3．4 BRs的缺失降低pag1株系的ABA含量

3．4 BRs的缺失抑制pag1中抗旱相关基因的表达

3．5 BRs的缺失影响pag1的能量积累

3．5．1 BRs的缺失影响pag1的淀粉积累

3．5．2 BRs的缺失影响pag1的光合作用速率

3．6 利用iTRAQ方法揭示pag1在干旱胁迫下的蛋白变化

3．6．1 热图分析pag1和CCRI24中的差异蛋白

3．6．2 维恩图分析pag1和CCRI24中的差异蛋白

3．6．3 pag1和CCRI24中差异蛋白的GO聚类分析

3．6．4 pag1和CCRI24中抗逆相关的差异蛋白

3．7 BRs的缺失影响pag1的农艺性状

4 讨论

4．1 BRs的缺失导致棉花对干旱胁迫的敏感性增强

4．2 BRs和生长素互作影响棉花的根系发育

4．3 BRs影响气孔发育

4．4 BRs和ABA互作影响气孔关闭

4．5 BRs的缺失导致pag1中抗逆相关基因下调表达

4．6 BRs影响棉花的光合作用与产量

参考文献

附录

作者简介

致谢