中国地区捻转血矛线虫苯并咪唑类抗药性相关基因Ⅰ型β微管蛋白编码基因多样性的研究

摘要

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是危害反刍动物最主要的病原之一，呈全球性分布，在热带和亚热带地区感染尤为严重，成虫主要寄生在反刍动物的皱胃及小肠，以吸取宿主血液为生，临床表现为贫血、水肿和腹泻等症状，严重时可引起宿主死亡。由于缺乏相应的商业化疫苗，应用化学驱虫药仍是治疗捻转血矛线虫感染的首要措施，但是长期无节制的使用药物，导致在全球范围内都出现了抗药性的问题，甚至有的地区已发展为多重抗药性。为了更好的制定有效的应对措施，延缓抗药性的产生，了解抗药性相关突变的起源与分布势在必行。
　　苯并咪唑类药物是最常用的三类驱虫药之一，也是目前抗药性机制研究最为透彻的。已经证明，捻转血矛线虫的Ⅰ型β微管蛋白基因的三个SNP位点(F167Y，E198A和F200Y)是引起苯并咪唑类产生抗药性的主要原因。国外已有大量关于捻转血矛线虫苯并咪唑类抗药性的报道，近些年还出现了抗药性突变起源和分布方面的研究，但是国内在此方面的研究相对匮乏，因此本研究通过对中国地区不同种群的捻转血矛线虫进行Ⅰ型β微管蛋白基因的分析，从而预测了抗药性的存在、抗药程度和分布情况，以及进行了种群遗传多样性分析和抗药性突变起源的分析。
　　(1)Ⅰ型β微管蛋白基因的多样性分析
　　选取了湖北、河北、云南、陕西、广西、内蒙古、辽宁和黑龙江八个种群，共192条捻转血矛线虫雄虫用于Ⅰ型β微管蛋白基因的扩增，并采用直接测序的方法进行三个SNP位点的检测。在中国的捻转血矛线虫种群中，都没有检测到167位点的突变(F167Y)，而198和200位点都出现了不同程度的突变(E198A和F200Y);根据198和200位点的突变情况，一共检测到了六种基因型;除此之外，计算了两个基因座的等位基因频率，在198位点，抗药型等位基因频率为0-70％;在200位点，抗药型等位基因频率为0-31％。
　　通过构建基因池对八个种群进行了遗传多样性分析和系统进化分析。结果表明，八个种群的单倍型多态性和核苷酸多态性都较为丰富，单倍型多样性(Hd)变化从0.455到0.939，核苷酸多样性指数(π)的变化从0.018到0.039;种群间配对的FST值都相对较低，从0.00907到0.30732，表明八个种群的遗传分化程度不高，种群之间存在较高的基因流动，中国地区的种群中没有较明显的遗传结构;AMOVA显示有93％的遗传变异来自种群内部，不同地理位置和不同宿主对中国的捻转血矛线虫的种群结构影响较小。
　　运用三种方法进行了系统进化分析，结果显示两个E198A的单倍型序列分布在进化网络图的两个不同的分支部分，同时每个分支还含有至少一个敏感型的单倍型序列，表明中国地区的捻转血矛线虫中E198A具有两个独立的起源;7个含有F200Y的单倍型序列分布在进化网络图的三个不同的分支部分，每个分支也含有至少一个敏感型单倍型序列，表明F200Y具有至少三个不同的起源。
　　(2)四引物ARMS-PCR检测方法的建立
　　基于本研究的结果，设计了四引物ARMS-PCR方法用于Ⅰ型β微管蛋白基因E198A的检测，并与直接测序结果进行准确度的比较。结果显示优化PCR反应体系，尤其是调整内外引物的浓度比例可以达到更好的扩增效果。通过琼脂糖凝胶电泳可以清晰的区分该位点三种不同的基因型，同时出现433bp和200bp表示纯合敏感基因型，同时出现433bp和284bp表示纯合抗药基因型，同时出现433bp，284bp和200bp表示杂合基因型。表明该方法可以成功用于捻转血矛线虫E198A的检测，并且准确度高，操作简单。
　　本研究首次对中国地区捻转血矛线虫的苯并咪唑类抗药性相关基因Ⅰ型β微管蛋白编码基因进行了多态性分析，在进行SNP检测的同时，分析了种群遗传多样性和抗药性的突变起源，从而填补了中国在此方面的研究空白，为后续相关研究及疾病防控提供了理论依据。

目录

声明

摘要

缩略语表

缩略语表(续表)

1 文献综述

1．1 捻转血矛线虫概述

1．1．1 捻转血矛线虫简介

1．1．2 捻转血矛线虫的形态结构及生活史

1．1．3 捻转血矛线虫的流行病学

1．1．4 捻转血矛线虫的致病作用和症状

1．1．5 捻转血矛线虫病的诊断及防治

1．2 寄生线虫抗药性的介绍

1．2．1 抗药性概述

1．2．2 国内抗药性的分布情况

1．2．3 国外抗药性的分布情况

1．3 抗药性机制的研究现状

1．3．1 大环内酯类

1．3．2 苯并咪唑类

1．3．3 烟碱激动剂类

1．3．4 氨基乙腈衍生物类

1．4 抗药性检测方法的研究现状

1．4．1 体内检测方法

1．4．2 体外检测方法

1．4．3 分子检测方法

2 研究目的与意义

3 材料与方法

3．1 实验材料

3．2 主要仪器和试剂

3．2．1 主要仪器

3．2．2 主要试剂

3．2．3 主要溶液的配制

3．3 试验方法

3．3．1 基因组DNA的提取

3．3．2 样品的分子生物学方法鉴定

3．3．3 Ⅰ型β微管蛋白编码基因DNA序列的获取

3．3．4 基因型和等位基因频率分析

3．3．5 Ⅰ型β微管蛋白编码基因的克隆测序

3．3．6 Ⅰ型β微管蛋白编码基因单倍型的确定

3．3．7 生物信息学分析

3．3．8 四引物ARMS-PCR特异性引物设计

3．3．10 四引物ARMS-PCR扩增检测E198A

4 结果与分析

4．2．1 PCR扩增结果

4．2．2 苯并咪唑类抗药性相关SNP的检测

4．2．3 基因型与等位基因频率

4．2．4 遗传多样性分析结果

4．2．5 种群结构分析

4．2．6 系统进化分析

4．3 四引物ARMS-PCR检测方法的建立

4．3．2 四引物ARMS-PCR检测E198A结果

5 讨论

5．1 中国地区捻转血矛线虫种群苯并咪唑类抗药性分析

5．2 捻转血矛线虫苯并咪唑类抗药性SNP的分布与起源

5．3 中国地区捻转血矛线虫种群的遗传多样性分析

5．4 四引物ARMS-PCR检测方法的分析

5．5 利用捻转血矛线虫进行抗药性的研究

6 结论

参考文献

致谢

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