油菜内生真菌CanS-34A抗真菌物质的分离纯化及结构鉴定

摘要

内生菌(endophytes)指的是在其生活史的部分或者全数阶段寄生于植物的组织内部，但不对植物造成危害的微生物。其中，内生真菌因其增强植物抗病性、产生活性代谢产物等作用，近年来成为寻找生防菌株的宝库。本研究对一株油菜内生真菌CanS-34A进行了分类属性鉴定，对其产生的抗真菌物质进行了防治油菜菌核病效果评估，以及化学结构解析。取得的研究结果如下:
　　1.明确了菌株CanS-34A的分类属性
　　采用形态特征观察和分子（ITS、RPB2、CaM及benA）鉴定方法，发现菌株CanS-34A属于Aspergillus capensis。
　　2.明确了菌株CanS-34A代谢产物防治油菜菌核病效果
　　通过平板对峙培养试验、发酵液抑制生长试验、离体及活体叶片接种等试验，发现菌株CanS-34A对核盘菌的拮抗性，其代谢产物能抑制核盘菌的菌丝扩展和菌核萌发，抑制核盘菌侵染。
　　3.明确了菌株CanS-34A抗真菌物质的基本性质
　　菌株CanS-34A抗真菌物质在60℃以下可保持活性，对紫外线辐射有一定的忍耐力，在碱性条件下活性较高。能特异性的抑制核盘菌科病原真菌（Sclerotinia属、Botrytis属和Monilinia属）及革兰氏阳性细菌。
　　4.从CanS-34A发酵液分离获得3种抗真菌化合物
　　采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、HPLC等方法对菌株CanS-34A抗真菌物质进行了分离和纯化，进而采用核磁共振和高分辨率质谱等方法对化合物纯品进行化学结构鉴定。发现所获得的3种化合物为penicillither、methyldichloroasterrate和rosellichalasin。生物活性测定结果表明，这些化合物对核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、三叶草核盘菌（Sclerotinia trifoliorum）、灰葡萄孢（Botrytiscinerea）及桃褐腐（Monilinia fructicola）均表现出抑制效果，其中rosellichalasin对核盘菌的抑制效果最强。
　　以上研究结果为开发菌株CanS-34A活性代谢物质防治油菜菌核病打下了基础。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 植物内生真菌研究进展

1．1．1 内生真菌的概念

1．1．2 内生真菌的代谢产物

1．1．3 利用内生真菌防治植物病害

1．2 曲霉研究进展

1．2．1 曲霉的生态学

1．2．2 分类方法

1．2．3 曲霉代谢产物

1．3 核盘菌菌核病研究进展

1．3．1 发生危害与病害循环

1．3．2 生物防治

1．4 本研究的目的、意义及主要研究内容

1．4．1 研究的目的意义

1．4．2 研究的主要内容

第二章 油菜内生真菌CanS-34A菌株分类地位

2．1 材料与仪器设备

2．1．1 试验材料

2．1．2 培养基与试剂

2．1．3 仪器与设备

2．2 试验方法

2．2．1 培养形态观察

2．2．3 CanS-34A菌株分子鉴定方法

2．3 结果与分析

2．3．2 CanS-34A菌株显微形态观察

2．3．3 CanS-34A菌株系统发育分析

2．4 讨论

第三章 菌株CanS-34A对核盘菌的拮抗性

3．1 试验材料与仪器

3．1．1 试验材料

3．2 试验方法

3．2．2 CanS-34A产生抗菌物质时间动态

3．2．5 CanS-34A发酵滤液对油菜的离体防效试验

3．2．7 数据统计分析

3．3 结果与分析

3．3．1 拮抗菌株的初筛结果

3．3．2 CanS-34A产生抗真菌物质的时间动态

3．3．3 CanS-34A发酵滤液对核盘菌菌丝生长的影响

3．3．5 CanS-34A发酵滤液在离体油菜叶片上对菌核病的防治效果

3．3．6 CanS-34A发酵滤液对菌核病的盆栽防效测定

3．4 结论与讨论

第四章 菌株CanS-34A抗菌物质的基本特性

4．1 材料与仪器设备

4．2 试验方法

4．2．2 CanS-34A粗提物浓度与抑菌效果的关系

4．2．5 菌株CanS-34A抗菌物质的紫外照射敏感性试验

4．3．2 CanS-34A抗菌物质的抑菌谱

4．3．3 CanS-34A抗菌物质的热稳定性测定

4．3．4 紫外照射对CanS-34A抗菌物质生物活性的影响

4．3．5 CanS-34A抗菌物质的酸碱稳定性探究

4．4 讨论

第五章 菌株CanS-34A抗菌物质的分离、纯化及结构鉴定

5．1 材料与仪器设备

5．2 试验方法

5．2．1 硅胶柱层析

5．2．2 收集组分活性检测

5．2．3 凝胶柱层析、硅胶柱层析及薄层层析分离

5．2．4 高效液相色谱法分离CanS-34A抗菌物质

5．2．5 生物活性测定

5．3 结果与讨论

5．3．1 CanS-34A粗提物硅胶柱层析分离

5．3．2 Sephadex LH-20凝胶柱层析分离CanS-34A抗菌物质

5．3．3 高效液相色谱法分离CanS-34A抗菌物质

5．3．4 CanS-34A抗菌物质结构鉴定

5．3．5 生物活性测定

5．4 讨论

第六章 全文总结与展望

参考文献

致谢