黄颡鱼MyD88依赖型信号通路相关基因的分子特征和表达分析

摘要

黄颡鱼是我国重要的淡水经济鱼类，但随其养殖规模的扩大，烂鳃病、水霉病等鱼类常见病害不断爆发，严重影响黄颡鱼产业的健康发展。目前，关于鱼类免疫方面的研究相对滞后，迫切需要我们加强对鱼类抵御病原入侵相关免疫反应的研究。先天性免疫是鱼类等低等脊椎动物抵御病原入侵的第一道防线，加强对黄颡鱼先天性免疫的研究可为鱼类疾病防治提供重要理论基础。Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）是识别外界病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular pattern, PAMP）的主要受体蛋白，在先天性免疫中发挥重要作用。在Toll样受体介导的髓样分化因子88（Myeloid differentiation factor88, MyD88）依赖型信号通路中，大部分的TLR与MyD88通过两者TIR结构域（Toll/IL-1R homologous region）的相互作用向下游传递信号从而激活免疫反应。本研究以黄颡鱼为研究对象，对MyD88依赖型信号通路相关基因 Pf_MyD88、Pf_IRAK4、Pf_IRAK1、Pf_TRAF6和 Pf_NFκB的分子特性及其在整个免疫反应过程中的表达量变化趋势进行研究，不但为鱼类疾病防治提供基础数据，而且可以为研究黄颡鱼MyD88依赖型途径在免疫反应中的重要地位提供相关数据。
　　本研究利用 RACE法快速克隆出黄颡鱼 MyD88依赖型信号通路相关基因Pf_MyD88、Pf_IRAK4、Pf_IRAK1、Pf_TRAF6和Pf_NFκB的部分cDNA序列，并利用荧光定量PCR（qPCR）检测了这几个基因在黄颡鱼成鱼多个组织、在整个早期胚胎发育不同时期、以及受嗜水气单胞菌刺激后在黄颡鱼肝、脾、头肾、中肾中的表达水平变化。主要研究结果如下：
　　1.黄颡鱼Pf_MyD88、Pf_IRAK4、Pf_IRAK1、Pf_TRAF6和Pf_NFκB基因部分cDNA序列的克隆与序列分析
　　黄颡鱼Pf_MyD88部分cDNA序列长1189 bp，包括699 bp的编码区和490 bp的3'-UTR，编码232个氨基酸；黄颡鱼Pf_IRAK4部分cDNA序列长1580 bp，包括1383 bp的编码区和197 bp的3'-UTR，编码460个氨基酸；黄颡鱼Pf_IRAK1部分cDNA序列长2188 bp，包括1983 bp的编码区和205 bp的3'-UTR，编码660个氨基酸；黄颡鱼Pf_TRAF6部分cDNA序列长2425 bp，包括1617 bp的编码区和808 bp的3'-UTR，编码538个氨基酸；黄颡鱼Pf_NFκB部分cDNA序列长2376 bp，包括1503 bp的编码区和873 bp的3'-UTR，编码500个氨基酸。同源性比对显示，黄颡鱼Pf_MyD88氨基酸序列与斑点叉尾鮰（Ictalurus punetaus）、纳氏锯脂鲤（Pygocentrus nattereri）和墨西哥脂鲤（Astyanax mexicanus）的相似度较高，依次为91％、84%和81%；黄颡鱼Pf_IRAK4氨基酸序列与斑点叉尾鮰、纳氏锯脂鲤和墨西哥脂鲤的相似度最高，依次为86%、76%和75%；黄颡鱼Pf_IRAK1氨基酸序列与斑点叉尾鮰、纳氏锯脂鲤和草鱼（Ctenopharyngodon idella）的相似度最高，依次为73%、66%和57%；黄颡鱼 Pf_TRAF6氨基酸序列与斑点叉尾鮰、纳氏锯脂鲤和团头鲂（Megalobrama amblycephala）的相似度最高，依次为90%、79%和76%。黄颡鱼Pf_NFκB氨基酸序列与斑点叉尾鮰、纳氏锯脂鲤和墨西哥脂鲤的相似度最高，依次为78%、70%和67%。
　　2.黄颡鱼Pf_MyD88、Pf_IRAK4、Pf_IRAK1、Pf_TRAF6和Pf_NFκB mRNA的组织表达
　　荧光定量 PCR结果显示，黄颡鱼 MyD88依赖型信号通路相关基因 Pf_MyD88、Pf_IRAK4、Pf_IRAK1、Pf_TRAF6和Pf_NFκB mRNA在检测的所有组织中都有表达，除 Pf_TRAF6基因之外，其他四个基因均在肝脏组织中的表达水平最高，其次为精巢，在其他组织中的表达水平均较低。Pf_TRAF6基因在精巢中的表达水平最高，其次为血液和肝脏。
　　3.黄颡鱼Pf_MyD88、Pf_IRAK4、Pf_IRAK1、Pf_TRAF6和Pf_NFκB mRNA在整个早期胚胎发育时期的表达量变化
　　黄颡鱼Pf_MyD88、Pf_IRAK1和Pf_TRAF6基因在整个早期发育过程中表达量的变化趋势相对一致。它们在整个胚胎发育过程中均有一定程度的表达，从受精卵到神经胚期均有较高水平的表达，且在受精卵时期表达量最高；从胚孔封闭期至孵出后1d的十个时期为中等表达；随后在孵出后3d迅速下降至极低水平并持续至30 d。黄颡鱼Pf_IRAK4和Pf_NFκB与其它三个基因的表达情况都不相同。黄颡鱼Pf_IRAK4 mRNA在胚孔封闭期的表达水平最高，在受精卵和多细胞时期的表达水平次之，在其他发育时期的表达水平较低。黄颡鱼Pf_NFκB基因从受精卵到孵出后1 d均有较高水平的表达，随后在孵出后3 d下降至较低水平并一直持续到孵出后30 d。
　　4.嗜水气单胞菌刺激黄颡鱼前后Pf_MyD88、Pf_IRAK4、Pf_IRAK1、Pf_TRAF6和Pf_NFκB mRNA表达量的变化
　　在使用灭活嗜水气单胞菌刺激黄颡鱼后，Pf_MyD88、Pf_IRAK4、Pf_IRAK1、Pf_TRAF6和Pf_NFκB这5个基因的mRNA表达水平在肝、脾、头肾和中肾四个组织中的变化趋势大体一致。在嗜水气单胞菌刺激后，这五个基因的表达水平逐渐降低，并在刺激后12 h降至最低水平。随后，表达水平在24 h升高至最高水平，然后逐渐降低，并在72 h降至较低水平。

目录

声明

缩略语表

第一章 文献综述

1 TLR相关研究进展

1.1TLR介导的信号通路

1.2鱼类TLR信号通路组成成分

1.3 Toll 样受体信号传导的功能

2 黄颡鱼研究概况

2.1 黄颡鱼的生物学特性

2.2 黄颡鱼的养殖现状

2.3 黄颡鱼的疾病防治

3 本研究的目的和意义

第二章 黄颡鱼Pf_MyD88、Pf_IRAK4、Pf_IRAK1、Pf_TRAF6和Pf_NFκB基因的克隆与序列分析

1 材料与方法

1.1实验鱼样本

1.2 主要实验仪器

1.3 药品与试剂

1.4 引物设计

1.5 实验方法

2 结果与分析

2.1 RNA的提取

2.2 黄颡鱼Pf_MyD88基因的分子克隆及特性分析

2.3 黄颡鱼Pf_IRAK4基因的分子克隆及特性分析

2.4 黄颡鱼Pf_IRAK1基因的分子克隆及特性分析

2.5 黄颡鱼Pf_TRAF6基因的分子克隆及特性分析

2.6 黄颡鱼Pf_NFκB基因的分子克隆及特性分析

3 讨论

第三章 黄颡鱼Pf_MyD88、Pf_IRAK4、Pf_IRAK1、Pf_TRAF6和Pf_NFκB基因的表达分析

1 材料和方法

1.1 实验内容及样本采集

1.2 主要实验仪器

1.3 主要药品与试剂

1.4 引物设计

1.5 实验方法

2 结果与分析

2.1 黄颡鱼Pf_MyD88、Pf_IRAK4、Pf_IRAK1、Pf_TRAF6和Pf_NFκB mRNA的组织表达

2.2 黄颡鱼Pf_MyD88、Pf_IRAK4、Pf_IRAK1、Pf_TRAF6和Pf_NFκB mRNA在早期胚胎发育时期的表达

2.3 嗜水气单胞菌刺激后黄颡鱼Pf_MyD88、Pf_IRAK4、Pf_IRAK1、Pf_TRAF6和Pf_NFκB mRNA表达的变化

3 讨论

3.3 嗜水气单胞菌免疫后黄颡鱼Pf_MyD88、Pf_IRAK4、Pf_IRAK1、Pf_TRAF6和Pf_NFκB mRNA表达的变化

参考文献

致谢