甘蓝型油菜自交不亲和相关基因的功能验证

摘要

自交不亲和作为杂种优势利用的重要途径之一，已经应用到芸薹属植物甘蓝、白菜和甘蓝型油菜上。芸薹属自交不亲和柱头识别基因和花粉识别基因分别为 SRK和SCR，但是自交不亲和信号转导路径还不清楚，只有少数基因如ARC1，THL1/2， MLPK，Exo70A1等得到报道。本实验室博士生杨永通过iTRAQ蛋白质分析技术筛选出16个自交亲和相关基因、3个自交不亲和相关基因。本文利用农杆菌介导下的油菜下胚轴遗传转化法对这19个基因进行功能验证，旨在寻找自交不亲和信号传导基因。
　　本研究主要内容包括：⑴利用自交亲和相关基因P51、P52、P53、P54、P56、P57、P58、P59、P63、P65、P66、P68的RNAi干涉载体分别转化亲和甘蓝型油菜‘Westar’，各获得T0代阳性植株13、9、5、11、14、47、8、5、23、4、10、9、4株。T0代植株收种后每株穴播3~4粒T1种子，出苗后移至大田。对每个载体分别取3株阳性苗，通过对柱头进行苯胺蓝染色法观察，发现这些载体的花粉管均出现了伸长，且自交亲和指数均大于2，表现出自交亲和。但是对平均每角果粒数的统计中发现，其中的基因P51，P53、P54、P57与P65在结籽率上明显低于野生型‘Westar’，说明抑制这些基因，可能一定程度上削弱了自交亲和性。⑵对于克隆出的3个自交不亲和性相关基因，构建过表达载体，转至亲和‘Westar’受体中，仅一个相关基因P38获得了T0代阳性转化植株22株。T1代植株的苯胺蓝染色结果为没有花粉管穿过，自交亲和指数为4.4，显著低于‘Westar’的23.9,说明过表达P38基因抑制了‘Westar’的亲和性，P38促进自交不亲和。

目录

声明

缩略语表

1 文献综述

1.1 植物的自交不亲和性及其类型

1.2 芸薹属植物自交不亲和性

1.2.1 S位点基因

1.2.2 自交不亲和下游信号传导因子

1.3 芸薹属植物柱头与花粉的互作

1.3.1 亲和反应的发生

1.3.2 不亲和反应的发生

1.4 甘蓝型油菜自交不亲和及其克服方法

1.4.1 甘蓝型油菜的自交不亲和

1.4.2 克服自交不亲和的方法

1.5 利用组学技术研究自交不亲和转导机制

1.6 研究的目的及意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株与载体

2.2 方法

2.2.1 CTAB法提取油菜DNA

2.2.2 油菜RNA提取和反转录

2.2.3 片段扩增、TA克隆及测序

2.2.4 农杆菌Gv3101感受态细胞制备

2.2.5 过表达载体构建

2.2.6 干涉载体构建

2.2.7 农杆菌介导的油菜遗传转化

2.2.8 转基因植物的种植及移栽

2.2.9 花粉管萌发观察

2.2.10 自交不亲和表型鉴定

3 结果与分析

3.1自交不亲和/亲和相关基因的获得

3.2 自交亲和/不亲和相关基因克隆及RNAi载体构建

3.3自交亲和性相关基因的功能验证

3.3.1 转基因植株的获得

3.3.2 转基因油菜阳性鉴定

3.3.3 花粉管萌发观察

3.3.4 结籽情况观察

3.4 自交不亲和候选基因的筛选与功能验证

3.4.1 过表达植株的获得

3.4.2 T0代转基因油菜阳性植株的分子检测

3.4.3 花粉管萌发观察

3.4.4 结籽情况观察

4 讨论

5 总结与展望

参考文献

附录

致谢