草鱼TRIM32基因克隆表达及其功能的初步研究

摘要

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)是我国重要的淡水经济鱼类，在我国多个地区大规模养殖。但是随着草鱼养殖业的大力发展，草鱼的各类疾病频繁爆发，目前尚无健康有效的治疗方法，这成为草鱼养殖难以突破的瓶颈，严重阻碍了草鱼养殖业的可持续发展。在抵御各种病原体的入侵时，天然免疫系统发挥着至关重要的作用。
　　TRIM(tripartite-motif protein)家族是机体先天性免疫的重要成员，在细胞的增殖、分化、肿瘤的抑制、病毒的抑制等方面发挥着重要的调控作用。TRIM家族蛋白，也称为RBCC家族蛋白，从N端到C端依次是RING结构域、B-box结构域、Coiled-coil结构域。在哺乳动物中TRIM32的RING结构域具有E3泛素连接酶的作用，可以调节信号通路的传导，参与机体的天然免疫反应。
　　本论文以草鱼TRIM32为主要研究对象，旨在为草鱼疾病的防御与治疗方面提供进一步的理论依据。主要研究内容包括以下几个方面:
　　1.利用PCR技术从草鱼的肝脏组织中克隆草鱼TRIM32基因的编码区全长，并翻译成对应的氨基酸序列。结果显示，草鱼TRIM32基因共1980 bp，编码660个氨基酸。
　　2.对草鱼TRIM32进行结构域分析、核苷酸序列比对以及遗传进化树分析。结果显示，草鱼TRIM32具有TRIM家族3个典型的结构域，与斑马鱼TRIM32的核苷酸序列同源性较高，且遗传进化树分析也与斑马鱼TRIM32聚为一支。
　　3.对草鱼TRIM32进行真核表达载体的构建，并通过间接免疫荧光和Western blotting分析草鱼TRIM32的表达与亚定位情况。结果显示草鱼TRIM32可以在EPC细胞中成功表达，主要以点状分布在细胞质中，而细胞核中的表达量较少。
　　4.采用qPT-PCR检测草鱼TRIM32的组织分布，分析结果显示草鱼TRIM32在被检测的11个组织中均有表达，其中在头肾组织中的表达量明显高于其他组织。
　　5.采用qPT-PCR检测草鱼TRIM32在不同胚胎发育时期的表达丰度，分析结果显示，草鱼TRIM32在受精卵时期、卵裂期和囊胚期的表达量显著高于其他时期(p＜0.05)，随后表达量下降，直到出膜后表达量再次显著性升高。
　　6.利用双荧光素酶报告系统检测草鱼TRIM32对NF-κB信号通路的影响。检测结果显示，实验组是对照组的1.66倍，说明草鱼TRIM32能够激活NF-κB信号通路，诱导下游的炎症反应。
　　7.构建了草鱼TRIM32原核表达载体，并制备了高效价的抗草鱼TRIM32的多克隆抗体。

目录

声明

摘要

缩略语表(Abbreviation)

1 文献综述

1．1 草鱼概述

1．2 鱼类天然免疫系统的研究

1．3 TRIM家族

1．3．1 TRIM家族的发现

1．3．2 TRIM家族的分类

1．3．3 TRIM家族的表达分布

1．3．4 TRIM家族与天然免疫

1．3．5 TRIM家族的其他功能

1．4 TRIM32的研究进展

1．4．1 TRIM32蛋白的结构特点

1．4．2 TRIM32蛋白在天然免疫中的作用与功能

1．4．3 TRIM32蛋白与泛素化

2 研究目的及意义

3 材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 质粒、菌株及细胞系

3．1．2 实验动物

3．1．3 实验试剂

3．1．4 主要培养基与试剂的配制

3．1．5 实验仪器与设备

3．1．6 引物设计

3．2 实验方法

3．2．1 目的基因的克隆

3．2．2 目的基因的序列分析及系统进化树分析

3．2．3 真核表达载体的构建与鉴定

3．2．4 间接免疫荧光检测

3．2．5 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

3．2．6 Western blotting检测

3．2．7 qRT-PCR检测

3．2．8 双荧光素酶报告实验

3．2．9 融合蛋白的纯化

3．2．10 蛋白质浓度的测定

3．2．11 ELISA试剂盒检测所制备抗体效价

3．2．12 统计学分析

4 结果与分析

4．1．2 TRIM32序列分析

4．1．3 TRIM32系统进化树分析

4．2 草鱼TRIM32的真核表达及亚定位

4．2．1 pcDNA4．0-TRIM32重组质粒的菌落PCR鉴定

4．2．2 TRIM32真核表达产物免疫印迹检测

4．2．3 TRIM32蛋白在EPC细胞中的亚定位

4．3 草鱼TRIM32的表达分析

4．3．1 草鱼TRIM32在不同组织的表达分析

4．3．2 草鱼TRIM32在不同胚胎发育时期的表达分析

4．4 草鱼TRIM32激活转录因子NF-κB

4．5．1 草鱼TRIM32原核表达载体的构建

4．5．2 草鱼TRIM32原核表达蛋白的检测及纯化

4．5．3 抗草鱼TRIM32多克隆抗体效价的检测

讨论

结论

参考文献

作者简介

致谢