猪圆环病毒感染小鼠模型及猪圆环亚单位疫苗免疫保护实验

摘要

猪圆环病毒（Porcine Circovirus type2，PCV2）的天然宿主是猪，各个日龄、不同性别的猪都易感。猪在感染PCV2后，病毒会损害其免疫器官，降低猪的抵抗力，引起猪的免疫抑制，容易与别的病原微生物混合感染。病毒感染5-12周龄的仔猪后会呈现断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）；猪皮炎肾病综合征（PNDS）发生在育肥猪，死亡率较低；猪繁殖障碍综合征主要威胁初产的后备母猪和新建的种猪群。近些年PCV2病毒在我国大多数地区被检出，给养猪行业造成了极大的困扰。目前能够预防猪被PCV2感染的方式是接种疫苗。国内外市场应用的疫苗多数是灭活苗和亚单位疫苗，大都是针对PCV2b型的疫苗。近些年的研究集中在利用原核表达系统表达PCV2b型病毒的衣壳蛋白，用来作制备亚单位疫苗，降低猪圆环亚单位疫苗的生产成本，具有良好的应用前景。小鼠是除了猪以外能够感染PCV2并传播的动物，而BALB/c小鼠感染PCV2的研究不多。在BALB/c小鼠上做攻毒模型试验，研究病毒在小鼠组织的增殖与分布规律，同时为今后亚单位疫苗保护效果的判定打下基础。主要研究内容如下：
　　1.BALB/c小鼠的攻毒模型的建立
　　在0d使用TCID50为106.73个/mL的PCV2病毒通过腹腔接种15只6周龄的雄性BALB/c小鼠0.5mL/只，对照组注射同体积的PBS。每间隔7d随机选择3只小鼠剖杀，共检测35d。试验得出：小鼠ELISA抗体水平呈现递增趋势，第7d时已经开始增长，到了第14d达到最高峰，持续到35d开始下降。实时荧光定量PCR结果发现病毒在小鼠体内感染初期分布于淋巴结和胸腺，随着时间推移PCV2在淋巴结、胸腺、脾脏和肾脏拷贝数较高，直到35d小鼠组织内仍然可以检测到PCV2，但是组织中病毒拷贝数大幅度下降。利用免疫组织化学技术对PCV2在小鼠体内分布进行定位，结果显示：在小鼠脾脏中，PCV2定位于脾红髓；在肺脏中定位于肺泡管壁细胞和肺泡上皮细胞，仅有少量病毒分布在小鼠肾脏的皮质部。
　　2.原核表达Lipo-Cap蛋白及亚单位疫苗的制备
　　在PCV2b缺失N端核定位序列（NLS）的ORF2基因前插入Lipoproteins序列并克隆入pET28a表达质粒，获得重组表达质粒pET28a-lipo-Cap。将构建好的表达质粒转化入含有分子伴侣质粒pGro7的感受态BL21菌株中诱导表达，经SDS-PAGE和Western blot检测到Lipo-Cap蛋白表达在上清中。分别优化诱导温度、诱导时间确定表达的最优条件是在16℃诱导18h。同时利用表达载体pET28a-Cap在大肠杆菌中表达Cap蛋白；重组杆状病毒rBac-3ORF2在Sf9细胞中表达ORF2蛋白。通过Ni柱纯化Lipo-Cap蛋白和Cap蛋白，得到Lipo-Cap蛋白浓度为337μg/mL，Cap蛋白浓度为356μg/mL。ORF2蛋白浓度约为97μg/mL。将这三种蛋白混合赛比克公司的ISA201VG和GEL01佐剂分别制备成抗原蛋白含量在50μg/mL的亚单位疫苗。
　　3.猪圆环病毒2型（PCV2）亚单位疫苗在BALB/c小鼠的免疫效果评价
　　在0 d将制备的疫苗免疫6周龄的雌性BALB/c小鼠0.2mL/只，在14d时进行加强免疫。检测小鼠的血清针对PCV2的ELISA抗体结果显示，各试验组抗体水平随时间增长，在42d各试验组ELISA抗体水平达到顶峰相比PBS组差异极显著（P<0.01），试验组之间差异不显著（P>0.05），GEL01+ORF2组抗体水平最高。小鼠脾淋巴细胞转化试验结果试验组与PBS组相比较，小鼠的淋巴细胞在接受刺激后淋巴细胞均发生增殖，差异显著（P<0.05），其中ISA201VG+ORF2组的刺激指数略高，但是差异不显著（P>0.05）。小鼠脾细胞体外培养，使用Cap蛋白刺激后收取培养基上清检测IFN-γ。Lipo-Cap组到第三天IFN-γ达到最高峰，与PBS组相比IFN-γ都有增加，差异显著（P<0.05），证明添加脂化蛋白能够起到调节小鼠体内IFN-γ的作用。加强免疫后21d对小鼠进行攻毒试验。荧光定量PCR检测显示：试验组中检测小鼠组织中的PCV2的拷贝数与PBS攻毒组相比显著减少（P<0.05），尤其是在淋巴结和胸腺组织。商品灭活疫苗能够很好的阻止病毒在小鼠组织中复制，试验组中ISA201+ORF2组在所有试验组中效果最好。病理切片结果显示：注射疫苗能够减轻病毒对组织的损伤，但不能完全中和病毒。
　　本实验通过小鼠攻毒模型得到BALB/c小鼠在免疫猪圆环病毒后病毒主要在胸腺、淋巴结和脾脏这些免疫器官中增殖。病毒具体在小鼠器官中的分布，在小鼠脾脏中定位于脾红髓；在肺脏中定位于肺泡管壁细胞和肺泡上皮细胞，仅有少量病毒分布在小鼠肾脏的皮质部。在猪圆环亚单位疫苗免疫保护试验中得到由猪圆环病毒衣壳蛋白混合佐剂在小鼠试验中能产生免疫作用，昆虫细胞表达的蛋白效果最好与商品化灭活疫苗相当，添加了脂化蛋白的衣壳蛋白在调节IFN-γ起到一定作用，但是佐剂效应还是不如商品化佐剂，无论是商品化疫苗还是亚单位疫苗都不能完全中和病毒，还是会造成小鼠组织的损伤。

目录

声明

缩略语表（Abbreviation）

1文献综述

1.1 PCV概述

1.2 PCV2病原学进展

1.2.1 猪圆环病毒病原学分类与形态

1.2.2 PCV2分子结构特征和结构蛋白

1.2.3 ORF2蛋白的可溶性表达研究进展

1.2.4 PCV2的传播途径

1.2.5 PCV2的致病机制

1.3.1 PCV2感染猪模型

1.3.2 PCV2感染小鼠模型

1.4 PCV2商品化疫苗研究进展

1.5 脂化蛋白的研究进展

2 目的与意义

3 材料和方法

3.1 实验材料

3.1.1 质粒、载体、菌株、细胞与病毒

3.1.2 质粒载体

3.1.3 主要试剂

3.1.4 相关溶液

3.1.5 主要培养基

3.1.6 主要仪器及设备

3.1.7 实验动物

3.1.8本研究所使用的引物

3.2.1 质粒构建

3.2.2 大肠杆菌工程菌的构建

3.2.4 蛋白纯化及浓度测定

3.2.5动物试验

3.2.6统计学方法

4.1小鼠攻毒模型试验结果

4.1.1小鼠攻毒模型ELISA抗体监测

4.1.2病毒在小鼠脏器的分布

4.1.3 PCV2感染小鼠的临床及病理学变化

4.1.4 接种PCV2病毒21 d后小鼠脾脏病毒分离结果

4.2.1 重组pET28a-Lipo-Cap表达载体的构建

4.2.2 重组pET28a-Lipo-Cap的原核表达

4.2.3 Western Blotting检测Lipo-Cap蛋白的表达

4.2.4 Cap蛋白的纯化及浓度测定

4.2.5 Lipo-Cap蛋白纯化和浓度测定以及ORF2蛋白浓度的测定

4.3小鼠的免疫原性试验

4.3.1小鼠血清中ELISA抗体水平检测

4.3.2小鼠脾淋巴细胞增殖试验

4.3.3小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ试验

4.3.4免疫小鼠产生针对PCV2的中和抗体滴度检测

4.4小鼠的攻毒保护试验

4.4.1免疫攻毒小鼠组织中PCV2拷贝数的测定

4.4.2 免疫攻毒小鼠组织的免疫组织化学和病理学检测

5讨论与结论

5.1讨论

5.2结论

参考文献

致谢