马铃薯ARGONAUTE基因家族成员的克隆、鉴定及表达分析

摘要

Argonaute蛋白是RNA诱导沉默复合体(RISC)的核心蛋白，它联合不同小RNA参与植物体内各种RNA沉默通路，在植物生长发育、抗逆境胁迫和抗病毒防御等生命过程发挥重要作用。本研究利用生物信息学方法在马铃薯中鉴定并克隆了14个StAGOs基因，并通过表达分析初步探究其基因功能。主要结果如下:
　　1.通过生物信息学方法找到了14个潜在的马铃薯AGO基因，分别编码475(StAGO4-3)到1127个氨基酸(StAGO1-2)。这些StAGOs基因分布在马铃薯第1、2、3、6、7、9、12号染色体上，对其编码蛋白的保守结构域分析发现StAGO4-3缺少PAZ结构域，可能为假基因，其余13个StAGOs基因包含AGO蛋白典型的保守结构域，鉴定确实为AGO基因家族的成员。
　　2.根据NCBI和PGSC数据库中StAGOs基因转录本序列信息，设计特异性引物，从马铃薯中克隆得到了14个StAGOs基因的全长cDNA序列，测序结果表明克隆的序列与数据库中的序列相似度从83.15％（StAGO2-2）到99.59％(StAGO1-2)，编码蛋白的相似度从66.22％（StAGO2-2）到99.73％(StAGO1-2)。克隆到的StAGOs基因与拟南芥和番茄AGO基因共同进行系统进化分析，发现马铃薯与拟南芥和番茄一样AGO家族成员可归类为三个进化枝，Cluster1包含StAGO1-1、StAGO1-2、StAGO5、StAGO10-1、StAGO10-2;Cluster2包含StAGO2-1、StAGO2-2、StAGO2-3、StAGO7;Cluster3包含StAGO4-1、StAGO4-2、StAGO4-3、StAGO4-4、StAGO16。
　　3.表达分析显示，StAGOs基因在根、茎、叶、花芽、块茎等组织中均能表达，但基因在不同组织中的表达量有明显差异，StAGO1-1、StAGO4-1、StAGO4-2、StAGO4-4、StAGO5和StAGO7在花芽中的表达量相对其他组织中更高，StAGO2-2、StAGO2-3和StAGO10-2主要在根和茎中表达。不同逆境处理后基因的表达分析表明StAGO2-3、StAGO5、StAGO10-1和StAGO16能响应低温、高温或盐胁迫。马铃薯植株接种PVY病毒后StAGOs基因的表达量变化分析可发现StAGO1和StAGO2在PVY病毒发生系统性侵染的时候显著上调表达，表明StAGO1和StAGO2可能是马铃薯主要的抗病毒AGO蛋白。构建了StAGO1和StAGO2的干涉表达载体进行马铃薯遗传转化，以期获得转基因株系进一步验证其抗病毒的功能。

目录

声明

摘要

缩略词表

1．1 课题的提出

1．2 文献综述

1．2．1 马铃薯主要病毒

1．2．2 RNA沉默抗病毒的机制

1．2．3 病毒对RNA沉默的反防御机制

1．2．4 AGO蛋白家族的研究进展

1．3 研究目的、内容与意义

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．2．1 StAGOs基因的数据库检索

2．2．2 StAGOs基因和蛋白的理化性质分析

2．2．3 StAGOs基因进化树分析

2．2．4 StAGOs基因启动子元件的分析

2．2．5 RNA提取和反转录

2．2．6 StAGOs基因的克隆

2．2．7 病毒接种和取样

2．2．8 ELISA检测病毒

2．2．9 StAGOs基因的表达量分析

2．2．10 转基因实验

第三章 结果与分析

3．1 马铃薯AGO基因的鉴定和生物信息学分析

3．2 马铃薯AGO基因的克隆

3．3 马铃薯AGO基因的表达分析

3．3．1 不同组织中StAGOs基因的表达模式分析

3．3．2 逆境处理下StAGOs基因的表达模式分析

3．3．3 PVY病毒侵染下StAGOs基因的表达分析

3．4 马铃薯转基因植株的获得与鉴定

3．4．2 干涉载体的构建

3．4．3 马铃薯试管薯遗传转化

第四章 讨论

4．1 马铃薯AGO基因的鉴定和生物信息学分析

4．2 马铃薯AGO基因的克隆

4．3 马铃薯AGO基因的表达分析

4．4 展望

参考文献

附录

致谢