FABP3对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的调控及机制研究

摘要

世界性多发性的奶牛乳房炎给奶牛健康、奶业经济带来极大的损害，随着人们对乳制品需求量及品质的不断提高，亟待建立防治乳房炎的有效技术。近年来随着分子生物学技术的发展，分子辅助选择已成为遗传改良与育种的重要手段，其重要基础和前提是掌握有效调控奶牛乳房炎的重要基因或重要分子标记。现有研究利用GWAS分析筛选出一个与奶牛乳房炎显著相关的SNP位点，在该位点周围1Mb范围内存在多个脂肪酸结合蛋白FABP（fatty acid binding protein）家族基因。FABP3（fatty acid binding protein-3）脂肪酸结合蛋白3是细胞内重要的脂肪酸转运蛋白，广泛存在于乳腺、心肌等组织中。FABP3通过介导脂肪酸转运参与脂质代谢、能量代谢、免疫调节等各生命活动。
　　因此，本研究以FABP3基因为研究对象，通过构建脂多糖(LPS)诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症模型，探讨FABP3对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的调控及其机制。得到主要结果如下:
　　(1)奶牛白细胞(PBL)和乳腺上皮细胞(bMECs)中FABPs表达水平:在奶牛白细胞(PBL)中，FABP3和FABP5高效表达，FABP4、FABP8、FABP9表达量较低;在奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)中，FABP3和FABP4高效表达，FABP5，FABP8和FABP9表达量较低;
　　(2)构建LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)炎症模型:确认0.5ug/ml和24h为LPS刺激奶牛乳腺上皮细胞的最佳浓度和时间，且与对照组相比，细胞凋亡水平无明显变化，细胞活性未受影响。即成功构建了LPS刺激乳腺上皮细胞的炎症模型;
　　(3)LPS刺激对奶牛白细胞(PBL)和乳腺上皮细胞(bMECs)中FABP3表达的影响:LPS(0.1ug/ml)诱导奶牛白细胞炎症反应，与对照组相比，3h、9h、12h FABP3的表达水平极显著上升(P＜0.01)，其中12h表达水平最高;LPS(0.5ug/ml)诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中，与对照组相比，12h、24h FABP3表达极显著上升(P＜0.01)，24h的表达水平最高;
　　(4)FABP3在LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)炎症中的作用:LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应中，siRNA干扰FABP3表达显著抑制炎症因子IL-6和IL-8的表达(P＜0.001);通过构建FABP3超表达载体，过表达FABP3极显著促进IL-6和IL-8的表达(P＜0.001);同时实验干扰FABP3后，极显著上调过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome Proliferator Activated Receptors)PPARα蛋白表达(P＜0.001)，极显著抑制LPS诱导的NF-κB-p65磷酸化(P＜0.001)从而抑制炎症信号通路的激活;
　　(5)不同脂肪酸对FABP3表达及LPS诱导的炎症反应的作用:棕榈酸（饱和脂肪酸）能极显著的促进FABP3的表达(P＜0.001)，且能极显著促进LPS诱导的炎症因子IL-6和IL-8的表达(P＜0.01);而硬脂酸（饱和脂肪酸）对FABP3和炎症因子的表达无显著影响;油酸（不饱和脂肪酸）能显著的抑制FAB3的表达，且能极显著的抑制炎症因子IL-6和IL-8的表达(P＜0.01)。
　　综上所述，FABP3在奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)和外周血白细胞(PBL)中均高效表达，且LPS有效地诱导细胞中FABP3的表达。干扰FABP3表达可通过上调信号通路中关键基因PPARα表达，抑制炎症信号通路NF-κB激活，从而抑制炎症因子IL-6、IL-8的表达，减轻乳腺上皮细胞炎症反应。不同脂肪酸对FABP3表达与LPS诱导的炎症反应有显著影响，其中油酸（不饱和脂肪酸）能显著的抑制FABP3的表达及细胞炎症反应。本实验结果为研究奶牛乳房炎相关免疫机理、防治奶牛乳房炎提供了新的实验依据和理论参考。

目录

论文说明

声明

摘要

缩略词表

1 前言

1．1 乳房炎的研究进展

1．1．1 乳房炎的危害

1．1．2 乳房炎的致病机理

1．1．3 乳房炎的防治措施

1．1．4 乳房炎抗病育种研究进展

1．2 奶牛乳腺上皮细胞脂多糖(LPS)炎症模型

1．2．1 LPS诱导乳腺上皮细胞炎症反应机制

1．2．2 奶牛乳腺上皮细胞脂多糖(LPS)炎症模型研究进展

1．3 候选基因FABP3研究进展

1．3．2 FABP3研究进展

1．3．3 其他重要FABPs调控炎症反应研究进展

2 研究目的与意义

3 材料与方法

3．1 实验材料

3．1．1 实验细胞、菌株

3．1．2 载体与质粒

3．1．3 工具酶与主要试剂

3．1．4 抗体、siRNA及主要化学试剂

3．1．5 培养基与抗生素及其配制

3．1．6 主要缓冲液与相关试剂及其配制

3．1．7 主要实验仪器及设备

3．1．8 分子生物学分析软件

3．2 实验方法

3．2．1 牛外周血白细胞(PBL)分离

3．2．2 牛乳腺上皮细胞(bMECs)复苏与培养

3．2．3 LPS、脂肪酸处理

3．2．4 RNA提取及反转录

3．2．5 检测尉BA表达水平

3．2．6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

3．2．7 免疫印迹

3．2．8 牛乳腺上皮细胞bMECs凋亡检测

3．2．9 FABP3基因沉默对LPS诱导的bMECs炎症反应的影响

3．2．10 过表达FABP3基因对LPS诱导的bMECs炎症反应的影响

3．2．11 统计学方法

4 结果与分析

4．1．2 FABP3和FABP4在奶牛bMECs细胞中高效表达

4．2．1 LPS刺激显著促进奶牛PBL细胞中FABP3的表达

4．2．2 LPS奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)炎症模型的构建

4．2．3 LPS刺激显著促进奶牛bMECs细胞中FABP3的表达

4．3 FABP3在LPs诱导的bMECs细胞炎症反应中的调控作用

4．3．1 干扰FABP3基因抑制LPS诱导的bMECs细胞炎症反应

4．3．2 FABP3超表达促进LPS诱导的bMECs细胞炎症反应

4．3．3 干扰FABP3可显著促进PPAR表达，抑制NF-κB信号通路的激活

4．4 脂肪酸对奶牛bMEcs细胞中FABP3表达及LPs诱导的炎症反应的作用

4．4．1 不同脂肪酸对FABP3表达及炎症因子表达的作用

4．4．2 不同脂肪酸对LPS诱导的bMECs细胞炎症因子表达的作用

5 讨论

5．2 FABP3对LPS诱导的乳腺上皮细胞炎症反应的影响

5．3 不同脂肪酸对FABP3表达及LPs诱导的乳腺上皮细胞炎症反应的影响

6 总结

6．1 结论

6．2 研究特色与创新

6．3 进一步研究内容

参考文献

致谢