中国甜柿自然脱涩相关基因ALDH2的功能分析

摘要

中国甜柿自然脱涩性状受显性单基因控制，因而在完全甜柿遗传改良中具有重大的应用价值，但其自然脱涩关键基因及其调控网络尚不完全明确。已知中国甜柿自然脱涩过程与乙醛介导的“凝固效应”（即可溶性单宁向不溶性单宁的转化过程）有关，但乙醛代谢下游的关键基因ALDH2（醛脱氢酶2基因家族）在其中的功能特性尚不清楚。本研究以中国甜柿（‘鄂柿1号’和‘罗田甜柿’），日本甜柿（‘阳丰’）和非完全甜柿（‘磨盘柿’）为试材，首先基于转录组数据库中ALDH2基因相关差异表达片段，从‘鄂柿1号’（Diospyros kaki Thunb.‘Eshi1’）中分离获得了ALDH2基因家族成员的cDNA全长，分析其表达模式并利用柿叶片瞬时表达技术体系对ALDH2基因进行功能验证;进而，应用酵母单杂交系统筛选与ALDH2基因互作的转录因子，进一步明确中国甜柿自然脱涩的分子调控网络;最后，结合转录组测序技术和柿瞬时转化体系，分析ALDH2及部分单宁代谢关键基因在中国甜柿叶片中瞬时超表达后的差异表达基因，进一步挖掘与中国甜柿自然脱涩直接相关的候选基因，以期为中国甜柿自然脱涩分子机理的解析及其遗传改良提供科学依据。
　　主要研究结果如下:
　　1.基于转录组数据库中的序列信息，通过cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)技术获得ALDH2基因家族两个成员——DkALDH2a和DkALDH2b，其cDNA序列全长分别为1，984bp和1，933bp，分别编码542和540个氨基酸。DkALDH2a和DkALDH2b在中国甜柿叶片中瞬时超表达后，叶片可溶性单宁和不溶性单宁含量均显著升高;瞬时干涉表达后，叶片中可溶性单宁含量前者无明显变化，后者显著降低。二者均可通过减少可溶性单宁的消耗进而抑制脱涩。
　　2.DkALDH2a主要作用于种子器官，其表达量在果实发育过程中逐渐降低，以致大量乙醛从种子扩散到果肉中，进而通过凝固效应促进脱涩。DkALDH2b主要是直接在果肉中大量表达，这可能是由于果肉中底物乙醛的积累所致，但其消耗的乙醛不足以阻止中国甜柿自然脱涩。因此，DkALDH2a和DkALDH2b的表达量与中国甜柿自然脱涩呈负相关关系。
　　3.基于DkALDH2a和DkALDH2b全长序列信息，通过染色体步移技术分别分离到515bp和1，209bp启动子序列。以DkALDH2b启动子构建pALDH2b-AbAi诱饵载体并转化Y1HGold酵母菌株，应用酵母单杂交技术从酵母文库中筛选到16个阳性克隆，经序列分析后新发现1个与ALDH2b互作的BBR/BPC1转录因子。
　　4.结合转录组测序技术和柿瞬时转化体系，筛选ALDH2及单宁代谢关键基因LAC1和ANR在中国甜柿叶片中瞬时超表达后的特异表达基因，共得到119.63GbClean Data。通过Trinity软件从头拼接(de novo assembly)，共得到192，597个转录本、100，371条Unigene。其中56，009条Unigene（约55.8％）获得了功能注释信息。注释为ERF家族的转录因子基因数目最高，且在三种处理中上调表达，说明其可能参与中国甜柿自然脱涩的调控过程。
　　综上所述，本研究明确了ALDH2基因家族的两个成员——DkALDH2a和DkALDH2b与中国甜柿自然脱涩之间的关系，并发现可能调控中国甜柿自然脱涩的两类转录因子BBR/BPC1和ERF。该结果为中国甜柿自然脱涩分子机理的解析及其遗传改良提供了参考。

目录

声明

摘要

缩略词表

1 课题的提出

2 前人研究进展

2．1 柿果脱涩机理研究进展

2．2 植物ALDH2基因家族研究进展

3 研究目的和内容

3．1 研究目的

3．2 研究内容

1 引言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 不同脱涩类型柿果发育过程中单宁含量变化比较

3．2 DkALDH2a和DkALDH2b的克隆及序列分析

3．3 DkALDH2a和DkALDH2b在不同脱涩类型柿果发育过程中的表达量分析

3．4 DkALDH2a和DkALDH2b在中国甜柿不同组织器官中的表达分析

3．5 DkALDH2a和DkALDH2b在活体柿叶片瞬时表达体系中的功能分析

4 讨论

第三章 应用酵母单杂交系统筛选DkALDH2互作转录因子

1 引言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 启动子序列分析

3．2 诱饵菌株AbAr基因本底表达水平检测

3．3 Y1HGold[pALDH2b-AbAi]文库筛选

4 讨论

第四章 ALDH2及部分单宁代谢相关基因瞬时超表达后的转录组分析

1 引言

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 实验方法

3 结果与分析

3．1 ‘鄂柿1号’叶片中单宁含量变化分析

3．2 组装结果概述

3．3 差异表达基因分析

3．4 OE-ALDH2b处理的差异表达基因分析

4 讨论

1 全文总结

2 本研究创新之处

3 本研究不足之处与进一步研究思路

参考文献

附录

作者在学期间的科研实践

致谢